Hieff Clone® Universal II One Step Cloning Kit是新一代的同源重组克隆试剂盒,精心优化的第二代2× Hieff Clone® Universal II Enzyme Premix预混了重组酶和重组反应所需缓冲液,并添加了独特的重组增强因子,用于同源重组可显著提高重组克隆效率。
该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任何载体的任何位点,兼容未纯化PCR产物、直接回收的PCR产物、低浓度的胶回收产物,本产品可重组同源臂GC含量30%-70%的接头片段。将载体完全线性化,并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的线性化载体末端同源序列,使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有与线性化载体两末端对应的完全一致的序列。PCR产物和线性化载体在重组酶的作用下,在50℃条件下最快仅需5 min即可完成重组反应。克隆阳性率可达95%以上。
组分信息
组分编号 |
组分名称 |
10923ES05 |
10923ES20 |
10923ES50 |
10923-A |
2 × Hieff Clone® Universal II Enzyme Premix |
50 μL |
200 μL |
500 μL |
10923-B |
500 bp control insert (25 ng/μL) |
5 μL |
5 μL |
5 μL |
10923-C |
pUC 19 control vector, linearized (50 ng/μL) |
5 μL |
5 μL |
5 μL |
储存条件
-25~-15℃保存,有效期1年。
简版使用说明
1.重组反应
1)线性化载体和插入片段使用量
Hieff Clone®重组反应体系各个片段及载体插入总浓度为0.02 - 1 pmol。载体与各个插入片段摩尔比为1:2*。对应的DNA质量可由以下公式计算获得:
pmol = (插入片段使用量ng) × 1,000 / (插入碱基对数 × 650 daltons)
50 ng 5,000 bp的DNA片段约为0.015 pmol
50 ng 500 bp的DNA片段约为0.15 pmol
*当插入片段长度大于载体时,最适载体与插入片段使用量的计算方式应互换,即插入片段当做载体,载体当做插入片段进行计算。线性化载体及插入片段的反应终浓度最低可达到1 ng/μL。线性化载体和插入片段扩增产物未纯化直接使用时,使用总体积应不超过反应体系体积的1/5,如20 μL体系不超过4 μL。
简便的投入量计算公式:插入片段投入量=2×插入片段长度×插入载体投入质量/载体长度
2)重组反应体系(可等比扩大或缩减反应体系,冰上配制,各组分使用前需混匀)
组分 |
重组反应体系 |
2× Hieff Clone® Universal II Enzyme Premix |
10 μL |
每个插入片段投入量 |
X |
目的载体投入量 |
Y |
ddH2O |
To 20 μL |
表1 反应体系
3)重组反应条件
连接片段数 |
重组反应时间 |
2 |
10 min |
3 |
20 min |
4 |
30 min |
5 |
40 min |
6 |
50 min |
表2 反应时间
最方便快捷的方法是菌落PCR。用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至菌落PCR Mix中混匀(如:2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye),Cat#10157ES),加入引物直接进行PCR反应。推荐至少使用一条通用测序引物进行菌落PCR,可以避免PCR假阳性的产生。后续也可用于酶切或测序鉴定。
注意事项
1.需自备的材料:
1)自备样品:自备好线性化载体和插入片段。
2)自备试剂(仅罗列部分):
3)自备仪器耗材(仅罗列部分):PCR仪,水平电泳槽,切胶仪,EP管等。
2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
3. 本产品仅作科研用途!
Ver. CN20231024
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