产品简介

 

Hieff Clone® Universal II One Step Cloning Kit是新一代的同源重组克隆试剂盒，精心优化的第二代2× Hieff Clone® Universal II Enzyme Premix预混了重组酶和重组反应所需缓冲液，并添加了独特的重组增强因子，可显著提高重组克隆效率。

该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任何载体的任何位点，兼容未纯化PCR产物、直接回收的PCR产物、低浓度的胶回收产物，本产品可重组同源臂GC含量30%-70%的接头片段。将载体完全线性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的线性化载体末端同源序列，使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有与线性化载体两末端对应的完全一致的序列。PCR产物和线性化载体在重组酶的作用下，在50℃条件下最快仅需5 min即可完成重组反应。克隆阳性率可达95%以上。

 

组分信息

 

 

储存条件

 

组分A、B、C：-25~-15℃保存，有效期1年。

组分D：室温保存，有效期2年。

 

性能展示

 

单片段6 μL小体系高效重组

图1. 在6 μL小体系非复苏感受态下，连接10 ng低投入量单片段。结果显示，10923ES性能好于竞品，连接效率高，菌落数多，阳性率达100%。A-B：重组转化平板。载体（10 kb）和插入片段（1 kb）摩尔比为1:2。C：插入片段PCR鉴定电泳图，M：Yeasen 10505ES。

低浓度多片段高效重组

图2. 分别连接低浓度的五片段和六片段。结果显示，10923ES在低浓度下连接性能稳定，菌落数多，阳性率100%。A-B：重组转化平板。载体（11.6 kb）和插入片段（5片段共5.6 kb、六片段共7.6 kb）摩尔比为1:2。C-D：插入片段PCR鉴定电泳图，M：Yeasen 10505ES，菌P长度2.6 kb。

 

简版使用说明

 

1. 重组反应

1）线性化载体和插入片段使用量

Hieff Clone^®重组反应体系各个片段及载体插入总浓度为0.02 - 1 pmol。载体与各个插入片段摩尔比为1:2*。对应的DNA质量可由以下公式计算获得：

50 ng 5,000 bp的DNA片段约为0.015 pmol
50 ng 500 bp的DNA片段约为0.15 pmol

*当插入片段长度＞载体时，最适载体与插入片段使用量的计算方式应互换，即插入片段当做载体，载体当做插入片段进行计算。

**线性化载体及插入片段的反应终浓度最低可达到1 ng/μL。当上述公式计算的值低于或超过体系范围时，直接使用最低/最高投入量即可。

***线性化载体和插入片段扩增产物未纯化直接使用时，使用总体积应不超过反应体系体积的1/5，如20 μL体系不超过4 μL。

• 简便计算公式：
• 推荐翌圣官网—支持中心—生物计算器—克隆连接投入量计算板块，输入片段数、浓度、大小，即可获得投入量：

https://www.yeasen.com/calculator.html#/cloning-link/

2） 重组反应体系（可等比扩大或缩减反应体系，冰上配制，各组分使用前需混匀）

表1 反应体系

阳性对照：排除实验材料及操作因素的影响。

阴性对照-A：确认线性化载体有无环状质粒残留；阴性对照-B：当插入片段原始质粒与载体有相同抗性时，确认插入片段有无环状质粒残留。

3）重组反应条件

1. 体系配制完成后，用移液器轻轻吸打混匀各组分，短暂离心将反应液收集至管底。
2. 当插入1个片段时，反应条件为50℃，5 min；当插入片段数为2-6个时，建议反应条件为50℃，10 -50 min（反应时间随片段数增多而延长，如表2所示）。超长载体片段连接，建议反应时间为40-60 min。

表2 反应时间

3. 反应产物可直接进行转化，也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。

2. 10 min快速转化

1）提前15分钟将用到的筛选培养基平板拿到37℃预热。

2）在冰上解冻快速克隆感受态细胞（如：DH5α Fast Chemically Competent Cell，Cat#11803ES）。

3）取10 μL冷却重组产物，加入到100 μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置5 min。

4）用200 μL移液枪将上一步的混合物转移到已经37℃预热的LB培养基上，均匀涂布。

5）将平板置于37℃培养箱倒置过夜培养。若进行蓝白斑筛选操作，平板在37℃至少倒置培养15 h。

3. 克隆鉴定

最方便快捷的方法是菌落PCR。用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至菌落PCR Mix中混匀（如：2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix，Cat#10167ES），加入引物直接进行PCR反应。推荐至少使用一条通用测序引物进行菌落PCR，可以避免PCR假阳性的产生。后续也可用于酶切或测序鉴定。

 

注意事项

 

1. 需自备的材料：

1）自备样品：自备好线性化载体和插入片段。

2）自备试剂（仅罗列部分）：

a. 超级感受态：转化效率＞10⁸ cfu/μg，如翌圣F DH5α快速超级感受态细胞（Cat#11803ES）。

b. 高保真酶：2× Hieff Canace^® AdvanceFast PCR Master Mix (With Dye)（Cat#10164ES）或其他等效产品。

c. 快速菌落PCR mix：2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix（Cat#10167ES）或其他等效产品。

d. 核酸染料：YeaRed Nucleic Acid Gel Stain (10,000× in Water)（Cat#10202ES），适用于紫外凝胶成像仪；YeaGreen Nucleic Acid Gel Stain (10,000×in Water)（Cat#10204ES），适用于紫外凝胶成像仪和蓝光切胶仪；或其他等效产品。

3）自备仪器耗材（仅罗列部分）：PCR仪，水平电泳槽，切胶仪，EP管等。

4）制备LB液体培养基、固体平板，操作步骤参考说明书“5. LB培养基配制”。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3. 本产品仅作科研用途！

 

常见问答

 

1、最佳克隆位点选择？

答：在选择克隆位点时，应避免选择克隆位点上下游50 bp内有重复序列的区域。当克隆位点上下游25 bp区域内GC含量均在40%-60%范围内时，重组效率将达到最大。若高于70%或者低于30%，重组效率会受到较大影响。

2、无克隆长出或克隆数较少？

答：出现该情况，建议使用阳性对照，可排除试剂盒本身的影响，并进行进一步判定，主要有以下可能情况：

1）引物设计不合适：推荐【同源序列（15-25 bp）+完整的酶切位点+基因特异性扩增引物】，GC含量40% - 60%。

2）感受态细胞效率低：使用新鲜制备或妥善冻存的感受态细胞，确保其转化效率>10⁷ cfu/μg。每次操作时可设置一组转化质粒的对照实验，以检测感受态细胞的转化效率。连接产物体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率。

3）线性化载体和插入片段扩增产物的使用量不足/过量，或者比例不佳：尽量按照推荐的量和比例配制重组反应体系。

4）线性化载体和插入片段扩增产物不纯，抑制反应：线性化载体和插入片段扩增产物未纯化，直接使用时，使用总体积应不超过反应体系体积的1/5，如20 μL体系不超过4 μL。建议线性化载体、插入片段扩增产物进行凝胶回收纯化，纯化产物溶解在ddH₂O中。

3、出现较多假阳性

答：主要有以下可能情况：

1）载体线性化不完全：即使是痕量未完全酶切的载体也会产生很高的转化背景。可通过阴性对照检测载体是否线性化完全，优化酶切体系，提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物等都可以有效减少环状质粒残留。

2）插入片段扩增产物混有非特异扩增产物：建议：①优化PCR体系，提高特异性；②胶回收PCR产物；③鉴定更多克隆。

3）反应体系中混入了相同抗性的质粒：PCR扩增模板(载体或插入片段)为环状质粒时，若扩增产物直接用于重组反应，残留环状质粒模板会产生较高的转化背景。建议使用预线性化质粒作为扩增模板、扩增产物进行DpnI消化或扩增产物进行胶回收纯化。

4、菌落PCR无条带

答：主要有以下可能情况：

1）引物不正确：推荐使用载体的通用引物或至少使用一条通用引物进行菌落PCR检测。

2）PCR体系或程序不合适：没有目的条带也没有空质粒条带，建议优化PCR体系、程序；或者提取质粒，以质粒做模板PCR验证；或者进行酶切验证。

3）重组失败：没有目的条带，只有空质粒的条带，说明重组不成功，载体线性化不完全，建议优化酶切体系。

5、测序无信号或测序插入片段序列突变

1）菌P条带亮，但测序无信号：建议进行双酶切验证，或者摇菌培养单菌落，提取质粒DNA重新验证。

2）插入片段序列突变/缺失几个碱基：查看测序图谱，比对碱基序列峰图，如为连续碱基，会有漏读或读错风险。

3）插入片段序列缺失/增加大片段序列：①插入片段与载体的部分位点存在同源互补序列。②实验中存在插入片段上下游引物（含同源臂）扩出的非特异条带。建议：目的片段切胶回收纯化。

Ver. CN20241126