亲爱的新生小伙伴们，开学的脚步越来越近啦！想必此刻的你们心中一定充满了对未知世界的憧憬与好奇吧？但与此同时，面对琳琅满目的实验材料和复杂的实验流程，是不是也有那么一点点小迷茫呢？别担心，小翌来帮忙！

分子克隆作为现代生物学研究中的基础技能之一，无论是基因功能的研究还是新药的研发，都离不开这一重要环节，小伙伴们在之后的生物实验中必然会接触到这个技术。你是否还在疑惑：“到底要怎么开始我的克隆实验呢？”接下来，就让我们一步步来梳理分子克隆实验方案的设计思路！

今天我们就以pUC19载体为例设计分子克隆实验方案吧。

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明确目的

通过分子克隆技术将小鼠的某一功能基因，连接到克隆载体上，进行下游的基因功能鉴定。

 

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确定载体

载体有三种来源途径：

 

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实验室改造的通用载体，通常是实验室根据通用的克隆和表达需求改造的，可能包括多个酶切位点、选择标记、报告基因等；

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市面上购买的标准载体，由生物公司提供，比如用于蛋白表达的pET系列，或者用于克隆的pUC系列，可以根据实验需要选择合适的标准载体；

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定制或特殊设计的载体：当现有的通用载体或市售标准载体不能满足特定的实验需求时，可以通过商业合成、利用分子克隆技术自行构建或与专业公司合作设计。

 

本次实验我们选用pUC19载体。

 

pUC19载体是一种常用的大肠杆菌克隆质粒载体，载体长2,686 bp。适合于DNA片段的克隆、进行DNA测序、对外源基因进行表达等。pUC19载体中含有多克隆位点（MCS），本次计划将目的片段插入到pUC19的MCS区域，MCS区域前有乳糖启动子（Lac promoter），通过乳糖启动子可以启动下游基因的表达，可以用于鉴定基因的功能。

 

图.pUC19载体图谱

 

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确定目的片段

确认实验中应用到的片段物种并查找序列。假设需要在载体上加入小鼠基因组DNA，可以使用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）在线查询，选择“Nucleotide”，输入小鼠拉丁文名称“Mus musculus”，点击查询后，获得1000多万条基因序列，如下图所示。

点击序列如小鼠matrix metallopeptidase 1b的mRNA序列（Mmp1b基因），进入界面后会给出该基因的来源物种、详细名称、功能描述、文献出处、核酸序列及氨基酸序列信息等信息。点击右上角的“Send to”可以获得该基因的完整序列（纯文本格式）。

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确定酶切位点

通过片段和载体比对，选取目的片段中不含有的酶切位点。使用Snapgene软件打开小鼠Mmp1b基因序列，点击“Enzymes”-“Choose Enzymes”。

在新弹出的界面中，输入pUC19载体多克隆位点中酶的名称，“Add”添加到右边栏目中，点击“ok”即可。

接着在下方栏目中点击“Enzyme”，选择“18 chosen enzymes do not cut”，在弹出的页面中，蓝色底纹即为目的片段上不含有的酶切位点，但载体多克隆位点上含有的酶切位点，本次一共找到18个酶切位点。

接下来，就可以选择根据目标基因的序列和pUC19上的酶切位点，选择合适的限制性内切酶对载体进行线性化处理，同时根据酶切位点设计扩增目的片段的引物。为了增加后续克隆连接的效率，建议选择酶切后会产生粘性末端的酶切位点，因此本次实验选择“EcoRI”和“SalI”两个酶切位点。

确认完载体、目的片段、酶切位点后，通过翌圣官网“支持中心”的“生物计算器”（https://www.yeasen.com/calculator.html#/double-enzyme/）设计目的片段两端的引物。

输入需要的载体序列和目的片段序列，选择合适的酶切位点（不建议选择载体和片段中都含有的酶切位点），生成引物，如图所示。

复制引物序列如下：

Forward 1: cgttgtaaaacgacggccagtgGTCACTGGTGATTTTCCCAGAGAAA

Reverse 1: gccaagcttgcatgcctgcaggTAGAGACAAGAGTGGCTTTATTTAA

获得载体、片段和引物序列之后，就可以通过Snapgene模拟载体片段同源重组，确认载体、片段设计是否有误，方案是否具有可行性。

模拟步骤后，验证载体、片段设计方案可行，该实验方案设计成功！之后我们就可以开展分子克隆实验操作啦~