克隆技术，又称为“生物放大技术”，目前应用最广泛的技术为“分子克隆”，即通过重组技术将目的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生新的遗传性状的技术。

大部分的分子克隆方法，诸如传统分子克隆、TA克隆、Gatway克隆、TOPO克隆、无缝克隆等都绕不开目的片段制备、载体制备、连接、转化、筛选等等步骤。其中，设计引物、载体和片段，都需要使用相应的分子克隆工具进行操作和模拟，接下来小翌会以同源重组为例，具体解析一下分子克隆技术中应用到的那些工具，为您的实验提供好方法。

基因组序列查询工具

进行分子克隆实验之前，需要根据下游实验目的，确认实验中应用到的片段物种并查找序列。假设需要在自己的载体上加入人基因组DNA，可以使用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）在线查询，选择“Nucleotide”，输入“human”，点击查询后，获得5000多万条基因序列，如图1所示。

图1. NCBI基因序列查询

点击序列如智人KIR3DL2蛋白的mRNA序列（KIR3DL2基因），进入界面后会给出该基因的来源物种、详细名称、功能描述、文献出处、核酸序列及氨基酸序列信息等信息。点击右上角的“Send to”可以获得该基因的完整序列（纯文本格式）。

图2. NCBI基因序列下载

目的片段和载体引物设计工具

获得目的片段后，根据同源重组原理，需要在插入片段的上下游引入15-25 bp的同源臂，GC含量40-60%，以保证片段与载体充分接触并进行重组。可以通过翌圣官网“支持中心”的“同源重组引物设计”点击进入，或者直接点击无缝克隆引物设计软件网址（https://www.yeasen.com/calculator.html#/cloning-link）进行设计引物。输入需要的载体序列和目的片段序列，选择合适的酶切位点（不建议选择载体和片段中都含有的酶切位点），生成引物，如图3、4所示。

图3. 翌圣官网设计软件

图4. 翌圣官网引物设计流程

值得注意的是，多个目的片段插入的双酶切位点，实际添加到第一个片段的5’端和最后一个片段的3’端，中间片段不含有设计的酶切位点。通过引物合成公司合成需要的引物序列。接着使用翌圣高保真PCR试剂盒（Cat#10164ES）PCR扩增目的片段与载体。

载体设计模拟软件

当设计完目的片段后，需要对载体和片段进行模拟连接，保证实验的准确性。可以使用Snapgene软件模拟。以pUC19为载体，KIR3DL2基因为插入片段，进行克隆连接模拟。选择“Actions”—“Gibson Assembly”—“Insert Fragment”，输入相应的插入片段和载体序列，如下图5所示，即可生成连接后的载体。点击新生成载体的“History”可以模拟载体与片段连接的具体步骤，如图6所示。

图5. Snapgene同源重组模拟流程

图6. Snapgene同源重组模拟图

模拟步骤后，即可使用翌圣新品通用型多片段快速克隆试剂盒（Cat#10923ES）连接目的片段，该试剂盒满足6 μL小体系、10 ng低浓度载体与片段的连接，菌落数多，克隆阳性率高，客户反馈效果好，如图7所示。

小体系低浓度载体高效率重组

实验信息：载体大小：5369 bp；目的片段大小：1589 bp。

实验数据：

图7. 10923ES在10 μL小反应体系下，低浓度载体（30 ng）连接单片段，阳性率100%。A：重组转化平板。B：插入片段PCR鉴定电泳图，泳道1-5分别为菌落1，菌落2，阴性对照，阳性对照（基因组作为模版），阳性对照（PCR纯化片段作为模版）。（上海交通大学）

除了上述基础的分子克隆技术应用工具外，还有如纽约大学研究人员开发的gRNA在线设计软件（https://cas13design.nygenome.org/），用于设计CRISPR-Cas13的gRNA引物等。分子克隆应用工具多种多样，应用好工具，能为我们的实验添砖加瓦。小翌在这里祝您实验顺利，一气呵成！关注我们，小翌会在下一期继续带来分子克隆方面的知识，为您的实验带来新的思路与方向，期待下一次的见面~

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