酶切点位

5'-G↓AATTC-3'

3'-CTTAA↑G-5'

 

产品描述

FuniCut™系列内切酶是通过基因工程重组技术，可在5~15 min内精确完成DNA切割的快速限制性内切酶，适用于快速切割质粒DNA、PCR产物、基因组DNA等。FuniCut™系列快速内切酶共用一种酶切缓冲液，从而简化了酶切反应体系，另外，有良好的酶活冗余度，可轻松处理底物过量或困难模板的酶切。

 

产品组分

组分编号	组分名称	产品规格
15010-A	FuniCut™ EcoRI	600 μL
15010-B	10×FuniCut™ Buffer	3×1 mL
15010-C	10×FuniCut™ Color Buffer	3×1 mL

 

运输与保存方法

冰袋运输。-20°C保存，有效期2年。

 

识别位置

5'-G↓AATTC-3'

3'-CTTAA↑G-5'

 

推荐反应条件

1× FuniCut™ 缓冲液；

最适37°C孵育。

 

失活条件

80°C孵育20 min。

 

注意事项

1）3 h孵育未表现星号活性，延时酶切可能出现星号活性；

2）受CpG甲基化影响，序列可能重叠，剪切受阻；

3）为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作；

4）本产品仅作科研用途！

 

质量控制

1. 功能活性检测：最适反应温度下，在20 μL反应体系中，1 μL酶能够在15 min内完全消化1 μg λDNA。

2. 超长时间孵育检测：最适反应温度下，将1 μL酶与1 μg λDNA共孵育3 h，未检测到其他核酸酶污染或星号活性引起的底物非特异性降解，但延长孵育时间可能出现星号活性。

3. 酶切-连接-再酶切检测：最适反应温度下，使用1 μL酶消化底物，回收酶切产物，在22°C下使用适量T4 DNA连接酶可以将酶切产物重新连接，将连接产物再次回收后，使用相同的内切酶可以重新切开连接产物。

4. 非特异性内切酶活性检测：最适反应温度下，将1 μL酶与1 μg超螺旋质粒DNA共同孵育4 h后，使用琼脂糖凝胶电泳检测，质粒DNA仍然处于超螺旋状态。

5. 蓝白斑检测：将含有单一lacZα基因的载体以1 μL酶消化，重新连接后转化入大肠杆菌感受态细胞，涂布在含有对应抗生素、IPTG和X-gal的LB培养基平板上。连接正确的产物会生长出蓝色菌落，而连接错误（即DNA末端切口不完整）的产物将得到白色菌落。对于FuniCut™系列限制酶而言，白色菌落比例应小于1%。

 

使用方法

1. DNA快速酶切流程

1）按如下建议的加样顺序配制体系反应液（冰上操作）：

组分	质粒DNA	PCR产物	基因组DNA
ddH2O	15 μL	16 μL	30 μL
10×FuniCut™ Buffer或10×FuniCut™ Color Buffer	2 μL	3 μL*	5 μL
底物DNA	2 μL（~1 μg）	10 μL (~0.2 μg)	10 μL (5 μg)
FuniCut™ EcoRI	1 μL	1 μL	5 μL
Total	20 μL	30 μL	50 μL

*本体系指已纯化后的PCR产物。未纯化的PCR产物具备一定的离子强度，10×FuniCut ^TM Buffer加入量可适当减少至2 μL。若下一步进行克隆等实验，酶切前需纯化PCR产物。

2）轻柔吸打或轻弹管壁以混匀（切勿涡旋），然后瞬时离心以收集挂壁液滴。

3）37°C孵育15 min（质粒），或15~30 min（PCR 产物），或30~60 min（基因组 DNA）。

4）80°C孵育20 min即可使酶失活，停止反应（可选）。

2. 双酶切或多酶切

1）每种内切酶的用量为1 μL，并根据需要适当扩大反应体系。

2）所有内切酶的体积总和不得超过总反应体系的1/10。

3）如果选用的几种内切酶的最适反应温度不同，应先以最适温度低的酶开始酶切，再添加最适温度较高的酶，以较高的温度进行孵育。

3.质粒的扩大反应体系

组分	体积（20 μL）	体积（20 μL）	体积（50 μL）
DNA	1 μg	2 μg	5 μg
FuniCut™ EcoRI	1 μL	2 μL	5 μL
10×FuniCut™ Buffer或10×FuniCut™ Color Buffer	2 μL	2 μL	5 μL
Total	20 μL	20 μL	50 μL

【注】：如果总反应体系大于20 μL，可使用水浴、金属浴或沙浴，并增加孵育时间。

 

不同DNA中的识别位点数

λDNA	ΦX174	pBR322	pUC57	pUC18/19	SV40	M13mp18/19	Adeno2
5	0	1	1	1	1	1	5

 

甲基化修饰影响 

Dam	Dcm	CpG	EcoKI	EcoBI
无影响	无影响	序列可能重叠 剪切受阻	无影响	无影响

 

不同反应缓冲液中的活性

反应缓冲液	FuniCut™ Buffer	Thermo Scientific FastDigest Buffer	NEB CutSmart® Buffer	Takara QuickCut™ Buffer
活性	100%	100%	100%	100%

【注】：活性数据来自翌圣生物限制酶标准反应体系下的检测。

 

同裂酶

FunII

【注】：同裂酶对于不同的甲基化修饰可能具有不同敏感性。

keywords: EcoRI、EcoR I、EcoR i、EcoR1、EcoR 1、EcoRⅠ、EcoR Ⅰ、EcoR

 

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