产品描述
天然蛋白A(Protein A)是一种发现于金黄色葡萄球菌的细胞壁表面蛋白,与分离自G型或C型链球菌属的蛋白G类似,主要通过与免疫球蛋白(Ig)的Fc区相互作用,结合大多数哺乳动物的IgG,可用于多种抗体(单抗和多抗)的分离纯化。在与不用的免疫球蛋白亚类的结合特性上,ProteinA 和Protein G结合性能不太一样(详见附录1)。
本品使用的是基因改造后的蛋白A,不仅维持其本身的Ig亲和特性,同时也去除了天然蛋白本身的非主要结合域以降低非特异性结合,rProtein A Agarose Resin 4FF以高度交联的琼脂糖凝胶为基质,重组Protein A为配基,具有很高的物理化学稳定性,可以在相对较高的流速下进行抗体的纯化,适用于工业客户。利用本品经过一步亲和层析,即可从腹水、血清和培养液等样品中得到高纯度的抗体,使用方便,应用广泛。
本品rProtein A 4FF Chromatography Column,1 mL是一种装填了rProtein A Agarose Resin 4FF的中压预装柱,规格1 mL,预装柱具有标准接口,可以适配商品化的各类中压色谱系统,如ÄKTA 等,方便客户操作。
产品性质
基质(Matrix) |
高度交联的4%琼脂糖微球 |
配体(Ligand) |
重组蛋白A |
孔径(Bead size) |
45-165 µm |
最大流速(Flowmax) |
0.3MPa,3bar |
储存缓冲液(Buffer) |
含20%乙醇的1×PBS |
载量(Capacity) |
>40 mg Rabbit IgG/ mL 基质 |
pH范围(pH range) |
3-12 |
运输与保存方法
冰袋运输。2~8℃保存,有效期2年。
需准备试剂
【注】建议以下缓冲液在使用前用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤。
结合/洗杂缓冲液:0.15 M NaCl, 20 mM Na2HPO4, pH7.0
洗脱缓冲液:0.1 M甘氨酸,pH 3.0
中和液:1 M Tris-HCl,pH 8.5
使用方法
【注】上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值,可以用结合/洗涤缓冲液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释,或者样品用结合/洗涤缓冲液透析。
1样品纯化(以Akta系统为例)
1)准备:将泵管道中注满去离子水。去掉上塞子,将层析柱连接至色谱系统中。再折断下口,将预装柱接到色谱系统中,并旋紧。
2)清洗:3-5倍柱体积去离子水冲洗层析柱中储存液。
3)平衡:用5倍柱体积的结合Buffer平衡层析柱,使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下,起到保护蛋白的作用。
4)上样:将样品加到平衡好的层析柱中,推荐流速1 mL /min,保证目的蛋白与树脂充分接触,提高目的蛋白的回收率,收集流出液,待检测。
【注】样品的粘度增加使得即使上样体积很少,也会导致层析柱很大的反压。上样量不要超过柱子的结合能力。大量的样品体积也可能造成很大的反压,使得进样器更难使用。
5)洗杂:用10-15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗,直到紫外吸收达到一个稳定的基线,去除非特异性吸附的杂蛋白,收集洗杂液。
6)洗脱:用洗脱Buffer 采用一步法或线性梯度洗脱。一步洗脱中,通常5倍柱体积洗脱液足够将目的蛋白洗脱下来。也可以用一个小的梯度,例如20倍柱体积或更多,来分离不同结合强度的蛋白质。
7)清洗及保存:依次使用3倍柱体积的结合Buffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料,最后再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡,然后保存在等体积的20%的乙醇中,置于4度保存,防止填料被细菌污染。
2 SDS-PAGE检测
将纯化过程中得到的样品(包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等)利用SDS-PAGE进行检测,判定其纯化效果。
3 树脂清洗
随着一些变性物质的沉淀和蛋白的聚集,往往造成流速和结合载量下降,影响柱子的性能,这时需对柱子进行清洗:
1)去除沉淀或变性物质
① 用2倍柱体积的6 M 盐酸胍溶液进行清洗;
② 用5倍柱体积的PBS,pH 7.4 清洗。
2)去除由于疏水性吸附造成的非特异吸附物质
① 用3-4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积的1% Triton™ X-100清洗;
② 用5倍柱体积的PBS, pH 7.4 清洗。
注意事项
1)请勿冷冻保存本产品。
2)所有操作过程中,样本需要在4℃或冰上操作。
3)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
4)本产品仅作科研用途!
附录1. 蛋白A,G对不同物种Ig的结合能力总表
免疫球蛋白亚型 |
Protein A |
Protein G |
免疫球蛋白亚型 |
Protein A |
Protein G |
Human IgG |
++++ |
++++ |
Mouse IgG |
++++ |
++++ |
Human IgG1 |
++++ |
++++ |
Mouse IgG1 |
+ |
++++ |
Human IgG2 |
++++ |
++++ |
Mouse IgG2a |
++++ |
++++ |
Human IgG3 |
+ |
++++ |
Mouse IgG2b |
+++ |
+++ |
Human IgG4 |
++++ |
++++ |
Mouse IgG3 |
++ |
+++ |
Human IgM |
Use anti-Human IgM |
Mouse IgM |
Use anti-Mouse IgM |
||
Human IgE |
NR |
NR |
Chicken IgG (IgY) |
NR |
NR |
Human IgA |
+ |
NR |
Cow IgG |
++ |
++++ |
Human IgA1 |
+ |
NR |
Goat IgG |
+ |
++++ |
Human IgA2 |
+ |
NR |
Goat IgG1 |
+ |
++++ |
Human IgD |
Use anti-Human IgD |
Goat IgG2 |
++++ |
++++ |
|
Rat IgG |
+ |
++ |
Goat IgM |
NR |
NR |
Rat IgG1 |
NR |
+ |
Guinea Pig IgG |
++++ |
++ |
Rat IgG2a |
NR |
++++ |
Guinea Pig IgG1 |
++++ |
++ |
Rat IgG2b |
NR |
+ |
Guinea Pig IgG2 |
++++ |
++ |
Rat IgG3 |
+ |
++ |
Hamster IgG |
+ |
++ |
Sheep IgG |
+ |
++ |
Horse IgG |
+ |
++++ |
Sheep IgG1 |
+ |
++ |
Rabbit IgG |
++++ |
+++ |
Sheep IgG2 |
+ |
++ |
Rabbit IgM |
NR |
NR |
Sheep IgM |
NR |
NR |
Rabbit All isotypes |
+++ |
++ |
Pig IgG |
+++ |
+++ |
Monkey IgG |
++++ |
++++ |
Cat IgG |
++++ |
+ |
Donkey IgG |
++ |
++++ |
Dog IgG |
++++ |
+ |
|
|
|
(+)= weak binding; (++)= moderate binding; (++++)= strong binding; NR= not recommended; (-)= not tested; |
附录2 常见问题与解答
问题 |
可能原因 |
推荐解决方法 |
柱子反压过高 |
填料被堵塞 |
清洗填料 |
裂解液中含有微笑的固体颗粒,建议上柱前使用0.22 µm/0.45 µm滤膜过滤。 |
||
样品纯化过程中曲线不稳 |
样品或 buffer 中有气泡 |
赶出气泡 |
样品和buffer进行脱气 |
||
洗脱组分中没有目的蛋白 |
样品中抗体浓度太低 |
使用其抗原做配体的介质 |
抗体被降解 |
适当的提高洗脱pH |
|
样品与Protein A结合力低 |
换用Protein G或Protein A/G树脂纯化 |
|
回收率逐渐减低 |
上样量太多 |
减少上样量 |
柱子太脏,载量降低 |
清洗树脂 |
HB230227
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