E.coli宿主细胞DNA残留检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中的E.coli残留DNA含量的试剂盒。

本试剂盒采用探针法荧光定量PCR原理，可专一快速的检测E.coli细胞的残留DNA，其最低检测限可以达到fg水平。该试剂盒需可与本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒（Cat#18461ES/18462ES）配套使用。

 

产品组分

组分编号	组分名称	产品编号/规格
		41304ES50（50T）	41304ES60（100T）
41304-A	E.coli qPCR mix	0.9 mL	1.8 mL
41304-B	E.coli Primer&probe mix	100 μL	200 μL
41304-C	DNA Dilution Buffer	2×2 mL	4×2 mL
41304-D	E.coli DNA Control（30 ng/μL）	25 μL	50 μL

【注】：本试剂盒不含ROX参比染料，若您目前使用的Real Time PCR扩增仪需要添加ROX参比染料，推荐您购买本公司的50× ROX Reference Dye（Cat#10200ES）。

 

运输和保存方法

1. 所有组分均干冰运输，-20℃保存，有效期2年。

2. 收到货后，请检查共4个组分是否齐全，并立即放入对应的保存温度中储存。

 

注意事项

1. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书，实验应规范操作，包括样本处理、反应体系的配制及加样。

2. 加样和配液步骤尽量都在冰上操作。

3. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀，低速离心。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5. 本产品仅作科研用途。

 

适用机型

包含但不限于以下仪器：

Bio-Rad：CFX96 Optic Module；

Thermo Scientific：ABI 7500；ABI Quant Studio 5；ABI Step OnePlus.

 

使用方法

一、E.coli DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备

用试剂盒中提供的DNA稀释液将DNA定量参考品进行梯度稀释，稀释浓度依次为300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL。

具体操作如下：

1. 将试剂盒中的DNA定量参考品和DNA稀释液置于冰上融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，低速离心10 sec。

2. 取6支洁净的1.5 mL离心管，分别标记为3 ng/μL，①，②，③，④，⑤。

3. 在标记为3 ng/μL的1.5 mL离心管中加入90 μL DNA稀释液和10 μL DNA定量参考品（30 ng/μL），即稀释为3 ng/μL，振荡混匀后短时间快速离心10 sec，该浓度可分装置于-20℃短期保存（不超过3个月），使用时避免反复冻融。

4. 在 ①，②，③，④，⑤ 管中先分别加入90 μL DNA稀释液，再进行梯度稀释，稀释方法如下：

稀释管	稀释比例	终浓度
①	10 μL 3 ng/μL+90 μL DNA Dilution Buffer	300 pg/μL
②	10 μL ①+90 μL DNA Dilution Buffer	30 pg/μL
③	10 μL ②+90 μL DNA Dilution Buffer	3 pg/μL
④	10 μL ③+90 μL DNA Dilution Buffer	300 fg/μL
⑤	10 μL ④+90 μL DNA Dilution Buffer	30 fg/μL

【注】：

1. 每个浓度做3个复孔，该试剂可测试30 fg/μL-300 pg/μL线性范围。若需要，可适当扩大或缩小线性范围。

2. 为减少反复冻融次数和避免污染，建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于-20℃。

3. 已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于2-8 ℃ 7天，若长时间不用，请放置于-20℃。

4. 为确保模板完全混匀，每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约1 min。

二、样本加标回收质控QC的制备

根据需要设QC中的E.coli DNA标准品浓度（以制备加3 pg/μL DNA量的样本加标回收为例），具体操作如下：

1. 取100 μL待测样本加入1.5 mL洁净的离心管中，再加入10 μL溶液③，混匀，标记为加标回收QC。
2. 加标回收QC和同批待测样本一起进行样本前处理，制备加标回收QC纯化液。

三、标准品回收质控QC的制备（可选）

根据需要设QC中的E.coli DNA标准品浓度（以制备加3 pg/μL DNA量的标准品回收为例），具体操作如下：

1. 取100 μL 溶液③加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为标准品回收QC。
2. 标准品回收QC和同批待测样本一起进行样本前处理，制备标准品回收QC纯化液。

四、阴性质控NCS的制备

根据实验设置阴性质控，具体操作如下：

1. 取100 μL样本基质溶液（或DNA 稀释液）加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为阴性质控NCS。
2. 阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理，制备成阴性质控NCS纯化液。

五、无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC，具体操作如下：

1. 无模板对照NTC无需进行样本前处理，在qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。
2. 每管或孔中的NTC样本为20 μL Mix混合液（即18 μL E.coli qPCR mix + 2μL E.coli Primer&probe mix）+ 20 μL DNA Dilution Buffer，建议配置3个重复孔的量。

六、反应体系

组分	体积（μL）
E.coli qPCR mix	18
E.coli Primer&probe mix	2
DNA template	20
总体积	40

【注】：

1. 根据反应孔数计算本次所需的Mix混合液总量：Mix混合液 =（反应孔数+2）× (18+2) μL（含有2孔的损失量）。通常，每个样本做3个重复孔。

2. 加样完成密封好管子后，请先低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，再震荡混匀5 sec以上，完全混匀反应液，再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，如有气泡，需将气泡排尽。

下图为参考板位：

该示例是对E.coli残留DNA qPCR法检测操作的展示，检测样本包括：1个无模板对照NTC、5个浓度梯度的DNA标准曲线、3个样本加标回收QC（即加样回收QC）、3个待测样本、3个标准品回收QC（可选）、3个阴性质控NCS（1个即可）。建议每个样本做3个重复孔。

七、扩增程序参数设置（两步法）（以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例）

1. 创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。
2. 创建1个检测探针，命名为“E.coli-DNA”，选择报告荧光基团为“FAM”，猝灭荧光基团为“none”。
3. 在“Assign target (s) to the selected wells”面板中，将标准曲线孔的“Task”一栏设置为“Standard”，并且在“Quantity” 一栏分别赋值为“300000”、“30000”、“3000”、“300”、“30”（含义为每孔的DNA浓度，单位为fg/μL），并且在相应的“sample name”一栏中命名为“300 pg/μL”、“30 pg/μL”、“3 pg/μL”、“300 fg/μL”、“30 fg/μL”；将无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“NTC”；将阴性质控NCS孔、待测样本孔、样本加标回收QC孔的“Task”一栏设置为“Unknown”，并且在相应的“Sample Name”一栏中分别命名为“NCS”、“TS”、“QC”，之后点击“Start Run”，开始仪器运行。

     4. 扩增程序设置：设置反应体积40 μL。

循环步骤	温度（℃）	时间	循环数
预变性	95℃	10 min	1
变性	95℃	15 sec	40
退火/延伸（收集荧光）	60℃	30 sec

八、qPCR结果分析

1.在“Analysis”的“Amplification Plot”面板中，系统会自动给出Threshold，有时系统给出的Threshold离基线太近，导致复孔之间Ct相差甚远，可手动调节Threshold 至合适位置，点击“Analyze”。此时可在“Multicomponent Plot”初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2. 在“Analysis”的“Standard Curve”面板中，可读取标准曲线的R²、扩增效率（Eff%）、斜率（Slope）、截距（Intercept）等。正常的标曲：R²＞0.99；扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内；Slope在-3.4左右。

3. 在“Analysis”的“View well table”面板中，“Quantity”一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS、样本加标回收QC的检测值，单位为fg/μL，后续可在检测报告中将单位换算成pg/μL或pg/mL。

 

HB221226