CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中的CHO残留DNA含量的试剂盒。

本试剂盒采用探针法荧光定量PCR原理，可专一快速的检测CHO细胞的残留DNA，其最低检测限可以达到fg水平。该试剂盒可与本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒（Cat#18461ES/18462ES）配套使用。

 

产品组分

组分编号	组分名称	产品编号/规格
		41301ES50（50T）	41301ES60（100T）
41301-A	CHO qPCR mix	1 mL	2 mL
41301-B	DNA Dilution Buffer	2×2 mL	4×2 mL
41301-C	CHO DNA Control（30 ng/μL）	25 μL	50 μL

【注】：本试剂盒不含ROX参比染料，若您目前使用的Real Time PCR扩增仪需要添加ROX参比染料，推荐您购买本公司的50× ROX Reference Dye（Cat#10200ES）。

 

运输和保存方法

1.所有组分均干冰运输，-20℃保存，有效期2年。

 2. 收到货后，请检查共3个组分是否齐全，并立即放入对应的保存温度中储存。

 

注意事项

1. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书，实验应规范操作，包括样本处理、反应体系的配制及加样。

2. 加样和配液步骤尽量都在冰上操作。

3. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀，低速离心。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5. 本产品仅作科研用途。

 

适用机型

包含但不限于以下仪器：

Bio-Rad：CFX96 Optic Module；

Thermo Scientific：ABI 7500；ABI Quant Studio 5；ABI Step OnePlus.

 

使用方法

一、CHO DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备

用试剂盒中提供的DNA稀释液将DNA定量参考品进行梯度稀释，稀释浓度依次为300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL、3 fg/μL。

具体操作如下：

1. 将试剂盒中的DNA 定量参考品和DNA稀释液置于冰上融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，低速离心10 sec。

2. 取7支洁净的1.5 mL离心管，分别标记为 3 ng/μL，①，②，③，④，⑤，⑥。

3. 在标记为3 ng/μL的1.5mL离心管中加入90 μL DNA 稀释液和10 μL DNA 定量参考品（30 ng/μL），即稀释为3 ng/μL，振荡混匀后短时间快速离心10 sec，该浓度可分装置于-20℃短期保存（不超过3个月），使用时避免反复冻融。

4. 在 ①，②，③，④，⑤，⑥ 管中先分别加入90 μL DNA稀释液，再进行梯度稀释，稀释方法如下：

稀释管	稀释比例	终浓度
①	10 μL 3 ng/μL+90 μL DNA 稀释液	300 pg/μL
②	10 μL ①+90 μL DNA 稀释液	30 pg/μL
③	10 μL ②+90 μL DNA 稀释液	3 pg/μL
④	10 μL ③+90 μL DNA 稀释液	300 fg/μL
⑤	10 μL ④+90 μL DNA 稀释液	30 fg/μL
⑥	10 μL ⑤+90 μL DNA 稀释液	3 fg/μL

【注】：

1. 每个浓度做3个复孔，该试剂可测试3 fg/μL-300 pg/μL线性范围。若需要，可适当扩大或缩小线性范围。

2. 为减少反复冻融次数和避免污染，建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于-20℃。

3. 已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于2-8 ℃ 7天，若长时间不用，请放置于-20℃。

4. 为确保模板完全混匀，每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约1 min。

二、样本加标回收质控QC的制备

根据需要设QC中的CHO DNA标准品浓度（以制备加3 pg/μL DNA量的样本加标回收为例），具体操作如下：

1. 取100 μL待测样本加入1.5 mL洁净的离心管中，再加入10μL 溶液③，混匀，标记为加标回收QC。
2. 加标回收QC和同批待测样本一起进行样本前处理，制备加标回收QC纯化液。

三、标准品回收质控QC的制备（可选）

根据需要设QC中的CHO DNA标准品浓度（以制备加3 pg/μL DNA量的标准品回收为例），具体操作如下：

1. 取100 μL 溶液③加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为标准品回收QC。
2. 标准品回收QC和同批待测样本一起进行样本前处理，制备标准品回收QC纯化液。

四、阴性质控NCS的制备

根据实验设置阴性质控，具体操作如下：

1. 取100 μL样本基质溶液（或DNA 稀释液）加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为阴性质控NCS。
2. 阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理，制备成阴性质控NCS纯化液。

五、无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC，具体操作如下：

1. 无模板对照NTC无需进行样本前处理，在qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。
2. 每管或孔中的NTC样本为20 μL CHO qPCR Mix + 20 μL DNA Dilution Buffer，建议配置3个重复孔的量。

六、反应体系

组分	体积（μL）
CHO qPCR Mix	20
DNA template	20
总体积	40

【注】：

1. 根据反应孔数计算本次所需的qPCR Mix总量：qPCR Mix =（反应孔数+2）×20 μL（含有2孔的损失量）。通常，每个样本做3个重复孔。

2. 加样完成密封好管子后，请先低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，再震荡混匀5 sec以上，完全混匀反应液，再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，如有气泡，需将气泡排尽。

下图为参考板位：

该示例是对CHO残留DNA qPCR法检测操作的展示，检测样本包括：1个无模板对照NTC、6个浓度梯度的DNA标准曲线、3个样本加标回收QC、3个待测样本、3个标准品回收QC（可选）、3个阴性质控NCS（1个即可）。建议每个样本做3个重复孔。

七、扩增程序参数设置（两步法）（以Bio-Rad公司CFX 96 qPCR仪、软件版本4.1.2433.1219为例）

1. 创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。
2. 创建1个检测探针，命名为“CHO-DNA”，选择“run setup”栏中的“select run type”下方的“user-define”，在“run setup”界面中开始程序、板位、通道的设置：

2.1 首先，在“protocol”下点击“Create New”开始设置PCR程序，设置好后点击“OK”，保存程序文件。

2.2 点击“Next”或者“plate”进入孔位设置界面，点击“create new”，在“Scan Mode”中可以选择“All Channels”或者“SYBR/FAM Only”选项。用鼠标勾选反应格，点击“select fluorophores”选项，勾选“FAM”后点击“OK”，在“sample type”选项下选择“unknow”（或其他样本类型），勾选“target name栏下的“load”右边的框，同时根据个人需求设置“target name”，也可不设置。根据个人需求在选项“Sample names”和“Biological Group”中输入样本名称和组别，也可不设置。点击“OK”保存好最后的结果文件。

2.3 点击“Next”或“Start run”，开始仪器运行。

3. 扩增程序设置：设置反应体积40 μL。

循环步骤	温度（℃）	时间	循环数
预变性	95 ℃	5 min	1
变性	95 ℃	15 sec	40
退火/延伸（收集荧光）	60 ℃	30 sec

八、qPCR 结果分析

1. 上机结束后，在程序的右上角点击“plate setup” 栏下的“view/edit plate”，选中标准品的反应格，在右侧的“sample type”栏下选择“standard”，设置好每个梯度的重复孔，在“loda concentration”下输入所做的浓度后按“enter”键确认，依次将标准品的梯度设置完成。
2. 点击“OK”，返回到初始界面，即可读取标准曲线的R²、扩增效率（Eff%）、斜率（Slope）、截距（Intercept）等。正常的标曲：R²＞0.99；扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内；Slope在-3.4左右。
3. 根据设置的样本名称和组别，读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本和样本加标回收等的检测值，单位为fg/μL，后续可在检测报告中将单位换算成pg/μL或pg/mL。

HB221226