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产品简介
Hieff UNICON® ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) 是2×实时定量PCR扩增的预溶液，具有荧光强度高，灵敏度高和特异性强，扩增产量高等特点。核心组分Hieff UNICON® Taq DNA聚合酶采用抗体法热启动，可以有效抑制样品准备过程中引物退火导致的非特异性扩增。同时配方添加了提升PCR反应扩增效率因子和均衡不同GC含量（30~70%）基因扩增的促进因子，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。该产品利用不同染料的混合变色反应来监控移液操作，有效降低了移液误差的发生。
组分信息
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组分编号 |
组分名称 |
11190ES03 |
11190ES08 |
11190ES60 |
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11190-A |
Hieff UNICON® ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) |
1 mL |
5×1 mL |
100×1 mL |
|
11190-B |
10×Dilution Buffer |
1 mL |
1 mL |
20×1 mL |
储存条件
-25~-15℃避光保存，有效期1年。
使用说明
- Hieff UNICON® ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix 中包含蓝色染料，10×Dilution Buffer为专用黄色浓缩模板稀释液。使用过程中，如需要进行模板示踪，则需稀释到1X作为模板稀释液使用，然后进行qPCR检测；如不需要进行模板示踪，则不使用Dilution Buffer即可。
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模板类型 |
10×Dilution Buffer使用方式* |
Dilution Buffer 终浓度 |
|
cDNA溶液、已溶解的质粒、基因组 |
若要稀释模板，则先使用无菌超纯水将模板稀释至目标浓度，后在每9 μL模板中加入1 μL 10×Dilution Buffer。 |
1× |
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未溶解的DNA粉末 |
使用无菌超纯水将10×Dilution Buffer 稀释至1×，使用合适体积的1×Dilution Buffer作溶剂溶解对应的DNA粉末。 |
1× |
*实际使用过程中也可按需使用其他方案，保证最终模板中Dilution Buffer浓度为1×即可。
- 推荐qPCR反应体系
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组分 |
体积 （μL）*** |
体积 （μL）*** |
终浓度 |
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Hieff UNICON® ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) |
25 |
10 |
1× |
|
Forward Primer (10 μM)* |
1 |
0.4 |
0.2 μM |
|
Reverse Primer (10 μM)* |
1 |
0.4 |
0.2 μM |
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模板DNA/cDNA** |
x |
x |
- |
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无菌超纯水 |
Up to 50 |
Up to 20 |
- |
*通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。
**如模板为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10，最佳模板加入量以保证扩增得到的Ct值在20-30个循环为宜。
***推荐使用20 μL或50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性；上机前需充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。
- 反应程序
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循环步骤 |
温度 |
时间 |
循环数 |
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预变性 |
95℃ |
2 min |
1 |
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变性 |
95℃ |
10 sec |
40 |
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退火/延伸* |
60℃ |
30 sec** |
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熔解曲线阶段* |
仪器默认设置 |
1 |
|
*退火温度和时间：请根据引物TM值和目的基因的长度进行调整。
**荧光信号采集：请勿忘记打开荧光信号采集，按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置。
***熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。
适用机型
本产品中预混了用以校正孔与孔之间荧光信号误差的ROX Reference Dye 1 (高浓度)，适用于以下荧光定量PCR仪：Applied Biosystems 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast, StepOne, StepOnePlus;以及其他需要添加高浓度ROX Reference Dye的荧光定量PCR仪。
引物设计指南
- 推荐引物长度25 bp左右。扩增产物长度150 bp为佳，可以在100 bp-300 bp内选择。
- 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60℃-65℃为佳。
- 引物碱基分布均匀，避免出现连续的4个相同碱基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。
- 引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。
- 引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物 3’端有2个碱基以上的非特异性互补。
- 设计完成的引物需要进行扩增效率的检测，只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。
注意事项
- 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
- 解冻后Master Mix可能出现絮状或白色沉淀，手握缓慢溶解并上下轻柔颠倒混匀至溶液澄清，不影响试剂性能。
- 使用前请上下颠倒以混匀Master Mix，请勿vortex避免产生气泡，影响定量结果。Master Mix经混匀短暂离心后即可使用。加样过程中吹打要轻，如果操作不慎Master Mix起泡，需再次离心方可使用。
- 由于本品检测灵敏度极高，易被空气中气溶胶污染。因此反应体系配制时请于超净工作台内进行，配制过程中请使用灭菌枪头、反应管，条件容许的实验室推荐使用专用的移液枪和带滤芯的枪头。
- 推荐使用本公司cDNA合成试剂盒（货号：11155ES），以有效去除RNA样品中残留的基因组。
- 本产品仅作科研用途！
Ver.CN20241016
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