——简单、快速、高效的克隆策略
Topo克隆技术是通过TOPO载体上偶联的异构酶(Topoisomerase)实现插入片段的快速克隆。不同于传统的TA克隆，Topo克隆技术能够在2-5 min内快速完成插入片段和载体的连接反应，操作简单，连接效率极高，克隆阳性率接近100%。
背 景
传统的TA克隆对于PCR产物的要求较高，而且连接反应时间很长，同时阳性率低，而且自连率很高，无形中会成倍地增加科研者宝贵的时间。翌圣生物推出Hieff Clone® TOPO系列克隆载体，能够快速而且高效地得到目的重组载体。Hieff Clone® Zero TOPO载体为零背景载体，载体骨架中含有自杀ccdB基因。此克隆方法无需蓝白斑筛选，阳性率100%。
Hieff Clone® Zero TOPO Simple系列载体，使用者在引入后续酶切位点进行酶切操作时，不会受到MCS位点的影响，从而增加酶切效率以及克隆成功率。
TOPO克隆原理
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克隆原理：Topo载体两端通过磷酸键偶联Topo酶，连接反应时，受插入片段的5'端羟基的攻击，磷酸键释放能量。利用该能量，插入片段5'端羟基与载体片段3'端磷酸基团连接在一起，Topo异构酶从载体分子上脱落，完成连接反应。 |
零背景载体：Hieff Clone® Zero Topo载体骨架中含有ccdB致死基因。当载体发生自连时，ccdB基因完整，会表达ccdB毒素蛋白，导致细菌死亡；当插入片段成功连接时，ccdB基因不完整，ccdB基因不能完整表达，细菌存活。 |
Zero TOPO克隆与TA克隆方法的比较
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类别 |
反应时间 |
反应温度 |
体系组成 |
克隆阳性率 |
PCR产物 |
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Zero TOPO |
2-5 min |
室温 |
载体+插入片段 |
★★★★★ |
Blunt载体无需加“A” |
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TA克隆 |
过夜 |
16℃ |
载体+插入片段+T4连接酶 |
★★ |
需要加“A” |
产品特点
快速：仅需2-5 min即可完成连接反应
高效：无自连现象，阳性克隆率100%
简便：只需加入目的片段即可
操作流程
产品实例
高效克隆1-5 kb基因
图1：Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Cloning Kit可有效克隆1-5 kb基因，成功率100%。A-C：TOPO克隆转化平板。D-F：插入片段PCR鉴定电泳图。
同类产品比较
图2：相同体系下，克隆3 kb目的基因，Hieff Clone®Zero TOPO-Blunt Cloning Kit较同类产品具有高连接效率。
部分发表文献
[1]. Tang Y Y, Li Y T, Zha X H, et al. A complement factor I (CFI) gene mediates innate immune responses in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco[J]. Genomics, 2020.
[2]. Zhu L, Xia C, Wu L, et al. The critical role of RasGRP4 in the growth of diffuse large B cell lymphoma[J]. Cell Communication and Signaling, 2019, 17(1): 92.
[3]. Liu Q, Zhang L, Shu Z, et al. Two paternal mosaicism of mutation in ELANE causing severe congenital neutropenia exhibit normal neutrophil morphology and ROS production[J]. Clinical Immunology, 2019, 203: 53-58.
[4]. Zhuang L, Ji Y, Tian P, et al. Polymerase chain reaction combined with fluorescent lateral flow immunoassay based on magnetic purification for rapid detection of canine parvovirus 2[J]. BMC veterinary research, 2019, 15(1): 30.
FAQ
» Q1：从质粒上酶切的产物可直接连接Topo载体吗？为什么？
A：Topo载体进行连接反应的时候需要5'羟基端和Topo酶发生反应。PCR产物5'羟基端没有磷酸化，可以直接进行TOPO克隆。但是，酶切产物5'端为磷酸化状态，可以直接进行TA克隆的，但是不能进行Topo克隆。如果需要，可以用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）进行去磷酸化处理后连接Topo载体。
» Q2：连接反应体系和反应时间以及温度对连接效率的影响大吗？
A：建议反应体系应控制在10 μL内，体系太小连接会受到影响。如果目的基因浓度太低，建议浓缩之后再连接，以提高连接成功率。插入片段使用量参考说明书。一般1-2 min即可完成连接反应，若想得到更多克隆，可适当延长至 5min，但不能超过5 min。室温反应即可。
» Q3：如何选择合适的载体？
A：若PCR产物为Taq酶扩增则选择TOPO-TA克隆载体系列，若PCR产物为高保真酶扩增则选择Blunt载体系列。Simple载体不含多克隆位点区，可根据客户需求在PCR扩增时添加自己需要的酶切位点。
» Q4：若是储存了很久的PCR产物还能用来做克隆吗？
A：建议采用新鲜的PCR产物会使连接效率更高一些，若是-20℃保存的一周内还可以使用。请避免PCR产物的反复冻融和降解。
» Q5：PCR扩增产物需要纯化吗？
A：先对PCR产物跑胶鉴定，若是PCR产物电泳条带单一、浓度较高且无引物二聚体可直接进行连接反应。若是有杂带或引物二聚体建议纯化之后再进行连接反应。
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产品信息
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名称 |
货号 |
规格 |
|
10909ES20 |
20 T |
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|
Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Simple Cloning Kit, MCS-Depleted |
10910ES20 |
20 T |
|
10907ES20 |
20 T |
|
|
10908ES20 |
20 T |
相关产品
| 产品定位 |
名称 |
货号 |
规格 |
| 常规克隆感受态 |
11802ES80 |
10×100 μL |
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| 常规克隆感受态 |
11801ES80 |
10×100 μL |
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|
快速克隆感受态，无需热激，10min 转化 |
11803ES80 | 10×100 μL | |
| 常规表达感受态 |
11804ES80 |
10×100 μL |
|
| 单片段同源重组 |
10911ES20 |
20 T |
|
| 多片段同源重组 |
10912ES10 |
10 T |
|
| 单多片段同源重组 |
10922ES20 |
20 T |
|
| 5s/kb，超快速高保真，保真保快 |
10164ES03 |
1 mL |
|
|
10164ES08 |
5×1 mL |
||
| 83×高保真mix，30%-70%GC兼容 |
10154ES03 |
1 mL |
|
|
10154ES08 |
5×1 mL |
||
| 52×高保真mix，30%-70%GC兼容 |
10149ES03 |
1 mL |
|
|
10149ES08 |
5×1 mL |
||
| 普通PCR |
10102ES03 |
1 mL |
|
|
10102ES08 |
5×1 mL |
||
| 安全无毒 |
YeaRed Nucleic Acid Gel Stain (10,000× in Water) YeaRed 核酸染料（10,000× 水溶液） |
10202ES76 |
500 μL |
| 常规条带分离 |
10208ES60 |
100 g |
