Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit是利用新一代拓扑异构酶(Topoisomerase)高效快速连接DNA片段的原理进一步研发而成,搭配高效的平末端化因子,兼容平末端产物及粘性末端产物的快速克隆。与传统的连接酶相比,具有以下优势:1) 快速,仅需5分钟即可完成连接反应。2) 高效,无自连现象,阳性克隆率接近100%,无需设置蓝白斑筛选;3) 可连接长达5 kb目的产物。
组分信息
组分编号 |
组分名称 |
10906ES08 |
10906ES20 |
10906ES50 |
10906-A |
2× Hieff Clone® Universal TOPO Cloning Premix |
25 μL |
100 μL |
250 μL |
10906-B |
1 kb control insert (40 ng/μL) |
10 μL |
10 μL |
10 μL |
10906-C |
M13 Forward Primer(10 μM) |
50 μL |
200 μL |
500 μL |
10906-D |
M13 Reverse Primer(10 μM) |
50 μL |
200 μL |
500 μL |
储存条件
-25~-15℃保存,有效期1年。
使用说明
组分 |
用量 |
2× Hieff Clone® Universal TOPO Cloning Premix |
5 μL |
插入片段* |
0.5-5 μL |
ddH2O |
To 10 μL |
*PCR 产物不能磷酸化。如扩增模板为质粒,模板质粒会在后续实验中引起假阳性,因此推荐PCR产物进行胶回收后连接。0.1-1 kb片段投入量推荐20-50 ng,1-2 kb片段投入量推荐50-100 ng,2-4 kb片段投入量推荐100-200 ng,4-5 kb片段投入量推荐200-300 ng。
混匀上述体系,于室温(20-37℃)反应5 min。连接反应不可于冰上进行。室温(20-37℃)下孵育时,建议孵育时间不超过5 min,如果PCR产物浓度较低或者片段较长,则可以适当延长孵育时间,不宜超过15 min(推荐使用25℃,PCR仪控温)。
1)在冰上解冻克隆感受态细胞(如:DH5α Chemically Competent Cell,Cat#11802ES)。
2)取10 μL冷却重组产物,加入到100 μL感受态细胞中,轻弹管壁数下混匀,在冰上放置25 min。
3)42℃热激60 sec,冰上孵育2 min。
4)加入500 μL SOC或LB培养基,37℃,200 rpm,摇菌60 min。
5)5000 rpm离心4 min,弃上清至100 μL,用剩余培养基重悬菌体。用无菌涂布棒将菌液均匀涂抹在含有正确抗性的平板上。待菌液被培养基吸收后,倒置平板,于37℃过夜培养。
可选择测序法或酶切法进行鉴定。用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至菌落PCR Mix中混匀(如:2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye),Cat#10157ES),加入引物直接进行PCR反应。测序引物:
M13F :GTAAAACGACGGCCAGT
M13R :CAGGAAACAGCTATGAC
载体信息
注意事项
1)自备试剂(仅罗列部分):
2)自备仪器耗材(仅罗列部分):PCR仪,水平电泳槽,切胶仪,EP管等。
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