主推款!通用平末端/TA末端TOPO克隆Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit

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产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

 

Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit是利用新一代拓扑异构酶(Topoisomerase)高效快速连接DNA片段的原理进一步研发而成,搭配高效的平末端化因子,兼容平末端产物及粘性末端产物的快速克隆。与传统的连接酶相比,具有以下优势:1) 快速,仅需5分钟即可完成连接反应。2) 高效,无自连现象,阳性克隆率接近100%,无需设置蓝白斑筛选;3) 可连接长达5 kb目的产物

 

组分信息

组分编号

组分名称

10906ES08

10906ES20

10906ES50

10906-A

2× Hieff Clone® Universal TOPO Cloning Premix

25 μL

100 μL

250 μL

10906-B

1 kb control insert (40 ng/μL)

10 μL

10 μL

10 μL

10906-C

M13 Forward Primer(10 μM)

50 μL

200 μL

500 μL

10906-D

M13 Reverse Primer(10 μM)

50 μL

200 μL

500 μL

 

储存条件

-25~-15℃保存,有效期1年。

 

使用说明

  1. 反应体系

组分

用量

2× Hieff Clone® Universal TOPO Cloning Premix

5 μL

插入片段*

0.5-5 μL

ddH2O

To 10 μL

*PCR 产物不能磷酸化。如扩增模板为质粒,模板质粒会在后续实验中引起假阳性,因此推荐PCR产物进行胶回收后连接。0.1-1 kb片段投入量推荐20-50 ng,1-2 kb片段投入量推荐50-100 ng,2-4 kb片段投入量推荐100-200 ng,4-5 kb片段投入量推荐200-300 ng。

  1. 反应条件

混匀上述体系,于室温(20-37)反应5 min。连接反应不可于冰上进行。室温(20-37)下孵育时,建议孵育时间不超过5 min,如果PCR产物浓度较低或者片段较长,则可以适当延长孵育时间,不宜超过15 min推荐使用25℃,PCR仪控温

  1. 转化

1)在冰上解冻克隆感受态细胞(如:DH5α Chemically Competent Cell,Cat#11802ES)。

2)10 μL冷却重组产物,加入到100 μL感受态细胞中,轻弹管壁数下混匀,在冰上放置25 min。

3)42热激60 sec,冰孵育2 min。

4)加入500 μL SOC或LB培养基,37200 rpm,摇菌60 min。

5)5000 rpm离心4 min,弃上清至100 μL用剩余培养基重悬菌体。用无菌涂布棒将菌液均匀涂抹在含有正确抗性的平板上。待菌液被培养基吸收,倒置平板,于37过夜培养。

  1. 克隆鉴定

可选择测序法或酶切法进行鉴定。用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至菌落PCR Mix中混匀(如:2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye)Cat#10157ES加入引物直接进行PCR反应。测序引物:

M13F :GTAAAACGACGGCCAGT

M13R CAGGAAACAGCTATGAC

 

载体信息

 

注意事项

  1. 需自备的材料:

1)自备试剂(仅罗列部分):

  1. 超级感受态:转化效率>108 cfu/μg,如翌圣DH5α超级感受态细胞(Cat#11802ES)
  2. 高保真酶: Hieff Canace® Plus PCR Master Mix (With Dye)(Cat#10154ES或其他等效产品
  3. 菌落PCR mix:2× Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye)Cat#10157ES或其他等效产品
  4. 核酸染料:YeaRed Nucleic Acid Gel Stain (10,000× in Water)(Cat#10202ES)或其他等效产品。

2)自备仪器耗材(仅罗列部分):PCR仪,水平电泳槽,切胶仪,EP管等。

  1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
  2. 本产品仅作科研用途!

400-6111-883