做染料法的qpcr，不要只看扩增曲线，更要看熔解曲线，熔解曲线单峰说明特异性良好，扩增结果可信。但是如果熔解曲线不是单峰，有多峰，说明可能形成了引物二聚体或者是非特异产物，也可能是试剂或者环境的污染造成的。那如何快速分辨到底属于哪种情况呢？今天教会大家一招非常使用的技巧，利用NTC反应，即可快速找到问题根源！

具体操作步骤：

样品反应孔：加入模板，引物,qPCR mix

NTC反应孔：加入水，引物，qPCR mix

一起上机反应，查看各自熔解曲线，根据熔曲结果可对应以下三种情况

情况一：引物二聚体

情况二：非特性扩增

情况三：试剂及环境污染

对于双峰，较多情况出现的都是引物二聚体，因此使用一款特异性好的qPCR mix就特别重要，从源头在一定程度上避免了这种困扰。

11185  Hieff UNICON® Advanced qPCR SYBR Master Mix

产品特色

· 特异性高：抗体法热启动&Buffer优化，最大程度减少二聚体生成

· 灵敏度高：可有效检测低拷贝数模板

· 高荧光值：荧光信号值更高，曲线线型更好，信噪比更高

· 精密度好：可精准区分2倍模板差异，复孔间差距小

· 多平台适用：适用于多种qPCR仪器，无需调整ROX浓度

· 特异性高

图.以人源cDNA为模板，扩增56组不同GC含量的基因片段(部分曲线如上方展示)，结果显示，11185ES的特异性优于其他品牌，数据统计显示11185ES在这些样本中非特异性概率约为5.4%，其他品牌在同种样本中的非特异性概率约为53.6%。

· 灵敏度高

图.分别在不同类型仪器上以101-107拷贝的IL23R质粒为模板，扩增IL23R基因。结果显示在不同浓度模板下，11185ES的灵敏度更加优秀，Ct值更小，同时荧光平台期更高，曲线线型更好，信噪比更高。

· 精准区分2倍模板差异

图.分别以稀释10倍、20倍、40倍、80倍、160倍、320倍、640倍的人源cDNA为模板，扩增人GAPDH基因。测试结果显示11185ES能有效区分2倍模板浓度差异。

*备注：模板浓度差5倍，Ct值则相差2.322，22.322=5

图.分别以人源cDNA原液稀释了20倍、100倍和200倍的cDNA为模板，扩增60%GC含量的基因片段。数据显示11185ES针对不同浓度模板的分辨率优于其他品牌，且荧光值更高，曲线线型更好，信噪比更高。