每次做完qPCR,看到结果正常，长吁一口气，但是结果不正常，你是否也会开始挠头，不知道从哪分析起？

最近线上收到好多小伙伴的求助：“我的qPCR结果又崩了！到底是我反转录没做好，还是qPCR本身出了问题？”

今天，我们就总结一下我们日常遇见的常见案例，教大家如何迅速判断问题根源。

遇到问题，先看内参

内参基因（如Actin、GAPDH、18S rRNA）的结果可以反推到一系列相关因素是否影响本次实验，举个例子：内参基因CT值在18-25之间，但是目的基因CT值大于30。

推理思路：

1、CT值在正常区间内，说明本次参与到qPCR的各因素：模板cDNA，内参引物，qPCR试剂均没有问题，那么问题出在哪？

第一，可能是目的基因本身在组织/细胞中表达量太低；

第二，qPCR引物设计问题，引物效率低、有二级结构、或者扩增片段太长了；

第三，qPCR反应条件：例如退火温度不合适、循环数不够。

解决方案

增加qPCR反应的模板量，例如减少模板稀释倍数，或者使用cDNA原液；

使用更高逆转效率的逆转录试剂盒，增加逆转录阶段的RNA投入量，例如此前投入500-1000ng，现在可以考虑投入3-4ug。

检查引物的序列是否容易形成二级结构，计算引物的扩增效率。

2、内参CT正常排查的原因会比较直接直观，那如果内参不正常呢？内参CT值大于25，目的基因CT也非常靠后，这种又是什么原因呢?

较可能原因通常是这么几类

第一，RNA降解导致RNA完整性差或者RNA纯度很低；

图1:完整的RNA电泳结果

第二，逆转录投入的RNA过少；

第三，逆转录酶失活或者qPCR酶失活。

解决方案：

重新评估RNA质量，跑胶看RNA28S/18S条带亮度

增加RNA模板量（建议20μl体系用500ng-1μg总RNA）

更换高效、稳定的逆转录试剂盒——比如我们的11155ES

11155ES产品特点

• 快速简便

累计耗时在7分钟多，时间上更加快速，对于实验量大(尤其是坚持用水浴锅)的小伙伴更加友好！

• 更高的合成效率

针对不同物种不同GC含量的靶标，表现出更高的cDNA合成效率。针对不同样本的RNA，使用不同反转录试剂按照各自说明书规定的程序进行cDNA合成，后续使用染料法qPCR进行qPCR。Delta CT 值 (∆CT)表明，相比于其他反转录试剂，新品11155ES可获得更高的cDNA得率，Ct值会更小。

• 更高灵敏度

可检测低至10 pg的RNA。将293T细胞RNA(a)和拟南芥RNA(b)连续梯度稀释，使用新品11155ES进行cDNA合成。在RNA起始范围(从10 pg到 1μg)内，相关系数R2仍可达到0.99，效率高达96.4%(293T细胞)和100%(拟南芥)。

• 能有效消化gDNA

以1000 ng人293T细胞DNA为模板，使用不同反转录试剂按照各自说明书规定的程序进行消化和反转录，同时设置不进行gDNA消化的实验组。后续使用染料法qPCR进行qPCR。数据显示，试剂可对gDNA进行有效消化。