作为一名天天在实验室埋头做qpcr的科研民工来说，qPCR需要看哪些曲线哪些指标大家一定不陌生，首先，扩增曲线要是一个平滑的S型曲线，CT值15-35之间。当然，除了要看扩增曲线和CT值，熔解曲线也要看，毕竟这是判断我们的产物是否特异，实验结果是否具备可信度的一个非常明显且有效的标准。标准的熔解曲线的特性：= 单峰 + 光滑 + 峰窄，Tm值通常在80℃-90℃之间。但是现实中大家肯定遇到过各种各样奇奇怪怪的峰型，今天就列举一些常见的熔解曲线图，给大家一一解析。

一、异常曲线图鉴及“抢救”方案

1. 双峰，且小峰在80℃之前（通常75℃左右）

特征：主峰右边（或左边）冒出一个小矮峰。

原因： 引物二聚体产生的峰。引物自结合，形成了很短的双链，Tm值自然偏低。

建议：

提高退火温度：把退火温度提高2-5℃。

降低引物浓度：引物太浓更容易配对，建议降低引物浓度试试。

重新设计引物：如果怎么调都不行，说明引物设计有缺陷，需重新设计。

2. 双峰，但小峰在80℃之后

特征：主峰旁边出现一个温度较高的肩峰。

原因： 这是典型的非特异性扩增。可能是扩出了更长的片段，也可能是基因组DNA污染（gDNA）。

建议：

排查gDNA：如果你的引物没有跨内含子，且样本是RNA反转录来的，大概率是gDNA污染。反转录时用DNase I处理，或者选择带gDNA去除的反转录试剂盒。

电泳验证：跑个胶看看，是不是扩增出了比目的片段更大的条带。

3. 单峰但不尖锐，峰型宽胖

特征：看起来像个“土包”，或者峰底很宽。

原因：有两种可能：一是存在大小相似的非特异产物跑分不开；二是目的片段本身GC含量过高导致结构不均一。

建议：

高分辨率电泳：用3%的琼脂糖胶或者PAGE胶跑一下，看看到底是单条带还是两条带。

优化高GC内容：如果是GC含量高，试试添加5% DMSO或甜菜碱，或者换用专门的高保真高GC酶。

4. 阴性对照（NTC）也有峰

特征： 空白对照（水代替模板）也出现了明显的熔解峰。

原因：

Ct<35且峰形好：污染。可能是引物、水或者Mix里有DNA模板，或者旁边的阳性孔操作时候污染到了NTC。

建议：

换新的水、新的引物，严格分区操作，必要时彻底清洁台面。

Ct>35且Tm<80℃：这是引物二聚体，尤其是在高循环数（35个循环后）出现属于常见现象，只要不影响实验组数据可用性，问题不大。

二、硬核产品推荐：让“异常”退！退！退！

说了这么多，其实选对“装备”能省一大半心。一款好的qPCR试剂，必须具备扩增特异性强的特点。

以下是经过市场验证的“实力派”，建议收藏：

11185产品特色

· 特异性高：抗体法热启动&Buffer优化，最大程度减少二聚体生成

· 灵敏度高：可有效检测低拷贝数模板

· 高荧光值：荧光信号值更高，曲线线型更好，信噪比更高

· 精密度好：可精准区分2倍模板差异，复孔间差距小

· 多平台适用：适用于多种qPCR仪器，无需调整ROX浓度

· 特异性高

图.以人源cDNA为模板，扩增56组不同GC含量的基因片段(部分曲线如上方展示)，结果显示，11185ES的特异性优于其他品牌，数据统计显示11185ES在这些样本中非特异性概率约为5.4%，其他品牌在同种样本中的非特异性概率约为53.6%。

· 灵敏度高

图.分别在不同类型仪器上以101-107拷贝的IL23R质粒为模板，扩增IL23R基因。结果显示在不同浓度模板下，11185ES的灵敏度更加优秀，Ct值更小，同时荧光平台期更高，曲线线型更好，信噪比更高。

· 精准区分2倍模板差异

图.分别以稀释10倍、20倍、40倍、80倍、160倍、320倍、640倍的人源cDNA为模板，扩增人GAPDH基因。测试结果显示11185ES能有效区分2倍模板浓度差异。

*备注：模板浓度差5倍，Ct值则相差2.322，22.322=5

图.分别以人源cDNA原液稀释了20倍、100倍和200倍的cDNA为模板，扩增60%GC含量的基因片段。数据显示11185ES针对不同浓度模板的分辨率优于其他品牌，且荧光值更高，曲线线型更好，信噪比更高。