高质量的原料试剂助力肿瘤耐药基因检测

癌症是一种多基因多因素疾病。遗传因素，包括原癌基因和肿瘤抑制基因的突变，会导致细胞复制率升高和细胞凋亡抵抗力。与此同时，非遗传因素包括表观遗传改造、辐射暴露;化学致癌物，包括铅、砷和真菌毒素;某些病毒和细菌，如人乳头瘤病毒（HPV）、丙型肝炎病毒和人类T细胞生长淋巴病毒;年龄;以及饮酒、吸烟、肥胖和营养不良等生活方式因素。据世界卫生组织（WHO）称，癌症是仅次于心血管疾病的第二大致死原因，每六例死亡病例中就有一例与癌症有关。

近年来在多种癌症治疗手段（化疗、靶向治疗以及免疫治疗等）被广泛应用，显著提升了患者的生存率与生活质量。然而，癌症的多药耐药性（MDR）问题伴随癌症治疗的整个周期。在肿瘤年死亡率中，属内在性多药耐药(MDR)的肿瘤，如消化系、呼吸系统、泌尿系统、中枢神经系统肿瘤所致者约占61%；属获得性耐药的肿瘤，如皮肤癌、乳腺癌、生殖器肿瘤、内分泌肿瘤、白血病和淋巴瘤所致者约占33%；这就是说，有90%以上的肿瘤患者化疗失败的原因都不同程度地与耐药有关。

肿瘤耐药的途径可能有：(1)膜药物排流泵或类似物，如P糖蛋白(P-gp)对药物的主动排出；(2)药物前体活化失败，如烟碱腺嘌呤二核苷酸磷酸；(3)机体解毒作用增强，如谷胱甘肽-S转移酶表达增强；(4)靶酶拓朴异构酶(TOP)I活性改变；(5)DNA修复能力增强；(6)凋亡通路受阻；(7)某些癌基因活化。抗药性是肿瘤化疗中的棘手问题，多药耐药是肿瘤化疗中存在的普遍现象，其耐药的机制是复杂的，是多种因素作用的结果，其主要原因有：(1)多药耐药基因及P-gp表达增强；(2)多药耐药相关基因及多药耐药相关蛋白表达增强；(3)耐药相关基因及耐药相关蛋白表达增强；(4)谷胱甘肽及其转移酶表达增强；(5)拓扑异构酶表达下降；(6)肿瘤细胞DNA损伤修复能力及抗凋亡能力增强等。

                                                            图：促成癌症多药耐药性的关键信号通路9日中国医师节，是属于千万医务工作者的专属荣光

目前，肿瘤治疗已进入分子靶点的个体化医疗时代，肿瘤的治疗已逐渐从以病理为主转变为病理与驱动基因共同决定选择的时代。肿瘤发生机制的复杂性也提示临床医生在选择治疗药物前，若能进行基因检测及分析，对于治疗的用药指导非常重要。肿瘤组织内的基因，持续不断的发生着变异，而且突变过程是完全随机的。有效的治疗手段，会影响突变发生的频率，减少有害突变发生的几率。因此，治疗一段时间以后，在发生耐药、疾病进展的情况下，可以再次进行基因检测，以发现是否有新的基因突变，进而采取新的治疗手段。例如：EGFR是肺癌最常见的驱动基因。EGFR敏感突变（如L858R、19-21外显子缺失）患者初始对EGFR抑制剂敏感，但约50-60%的患者会出现T790M继发突变，导致对一代EGFR抑制剂（如吉非替尼、厄洛替尼）耐药。T790M突变患者可以换用三代EGFR抑制剂（如奥西替尼）。除了T790M，还有其他EGFR继发突变（如L792H、L844V等）可导致耐药。此外，MET基因扩增、HER2突变、BRAF突变等旁路激活机制也是EGFR耐药的重要原因。

肿瘤耐药基因检测具有多个难点：（1）肿瘤耐药检测的样本通常是血液（ctDNA）或组织活检，血液样本中的ctDNA浓度极低（通常<1 ng/mL），且易被核酸酶降解。组织样本中肿瘤细胞的比例可能很低（某些情况下<10%），导致耐药突变被大量正常细胞DNA稀释。样本采集、运输、储存的每一个环节都可能影响ctDNA的完整性和浓度，进而影响检测结果的准确性。（2）耐药突变通常在肿瘤细胞群体中的频率较低。例如，T790M突变在EGFR敏感突变肺癌患者中的频率通常为5%-30%，某些情况下甚至<1%。这意味着检测方法需要具有极高的灵敏度，能够在大量野生型背景中检出低频突变。传统的Sanger测序灵敏度仅为15%-20%，无法检出低频突变。数字PCR（ddPCR）和高深度NGS可以达到0.1%-1%的灵敏度。（3）肿瘤耐药通常不是单一机制，而是多种机制的组合。需要同时检测多种类型的变异。NGS可以同时检测多种类型的变异，但是为了检出低频突变，需要进行深度测序（通常>10000×）。（4）在极高深度的测序中，测序错误、PCR偏好、文库构建偏差等因素都可能导致假阳性。需要通过严格的质量控制和生物信息学方法来区分真实的低频突变和假阳性。

NGS检测的整个流程包括：样本采集→核酸提取→文库构建→靶向捕获→上机测序→生物信息学分析→临床报告。其中，文库构建是连接核酸提取和测序的关键环节，文库构建原料试剂盒的质量直接影响最终的检测结果。翌圣生物作为高通量测序领域的核心酶原料供应商，凭借六大核心技术平台（双向分子酶理性设计与定向进化平台、蛋白高密度发酵与超洁净纯化平台、分子诊断试剂关键原料研发平台等）与多年行业积累的经验，构建了覆盖核酸提取（DNA或RNA）、DNA或RNA文库构建、文库定量、文库质检、文库pooling（文库混合）、文库转化甚至是自动化流程的搭建等全系列产品矩阵，助力科研人员高效开展肿瘤耐药基因NGS检测技术的相关研究。

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图：促成癌症多药耐药性的关键信号通路