背景介绍

血管是人体循环系统的核心组成，贯穿全身各器官，承担营养输送、代谢废物排出等关键功能。血管类器官是由干细胞诱导分化形成的三维结构，能高度模拟体内血管的形态与功能，为血管发育研究、血管疾病建模及药物筛选提供了理想的体外模型[1]。传统血管类器官培养依赖复杂的生长因子组合，操作繁琐且重复性差，而小分子化合物可通过精准调控细胞信号通路，简化培养流程、提升类器官均一性，成为近年来血管类器官培养的核心技术[2]。目前，小分子诱导培养的血管类器官已广泛应用于糖尿病血管病变、肿瘤血管生成等领域的研究，为再生医学发展提供了重要支撑。

 

图1 血管类器官生成的步骤和时间表方案[1]

培养方案

本方案参考高分文献优化，操作简便、重复性强，适合入门级培养，核心依赖小分子化合物调控细胞分化，全程需在无菌环境下进行。

1.  细胞准备：选用人诱导多能干细胞（hiPSCs），培养于Essential 8（E8）培养基中，每3-4天传代一次，确保细胞活力≥90%。

2.  凝胶铺板：将Ⅰ型胶原酶与基底膜基质按比例混合，调节pH至7.3，加入12孔板，37℃孵育2小时固化，形成支撑基质[1]。

3.  小分子诱导：将细胞聚集体接种至固化凝胶上，加入含小分子化合物的诱导培养基——第0天添加4 μM CHIR-99021（GSK3β抑制剂）和5 ng/mL FGF2，第3天加入5 μM IWR（Wnt信号通路抑制剂），第5天添加50 ng/mL VEGF和10 μM Y-27632（Cat# 53006ES或52604ES）（ROCK抑制剂）[2]。

4.  培养维护：置于37℃、5% CO₂培养箱中，每2天更换一次诱导培养基，7-10天可形成具有初步血管网络的类器官，15天左右完成成熟血管类器官培养[1]。

5. 观察鉴定：通过倒置显微镜观察血管类器官形态，可采用免疫荧光染色检测PECAM1（内皮细胞标志物）表达，验证类器官有效性[2]。

 

图2 血管类器官中血管网络的免疫荧光特征分析[1]

(A) 代表性图像显示了组织清理后玻璃皿中嵌入凝胶的血管类器官。这些类器官是透明的，但在 385 nm 紫外光下可见。(B) 第 17 天血管类器官的代表性三维整体图像。血管类器官用 DAPI（蓝色）、血管内皮细胞标志物 CD31（绿色）和周细胞标志物 PDGFRβ（品红色）染色。(C) 第 28 天取出的血管类器官的代表性整体三维成像，用内皮标志物 CD31（红色）和 ERG1（绿色）染色。比例尺：150 μm。

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参考文献

[1] Xu C, He S, Zhu Y, et al. Vascular Organoid Generation from Human-Induced Pluripotent Stem Cells[J]. JoVE, 2024, DOI: 10.3791/67125-v.

[2] Zhao Y, Sun M, Pan Z, et al. A novel quantitative angiogenesis assay based on visualized vascular organoid[J]. Angiogenesis, 2024, 27(4): 38.