研究背景

前列腺癌作为男性常见的恶性肿瘤之一，由于其复杂的微环境和显著的肿瘤异质性，使得传统的二维细胞培养技术和动物模型在研究过程中面临诸多挑战。类器官模型作为一种新兴的三维体外培养体系，在癌症研究领域中逐渐成为不可或缺的研究工具。类器官技术能够较好地再现原发组织的结构与功能特性，从而更准确地反映前列腺癌生物学行为如生长、转移及对药物反应等现象。

培养方案

本手册依托美国国立卫生研究院（NIH）国家癌症研究所Muthuswamy实验室优化的专属方案编制[1]，聚焦前列腺肿瘤来源类器官（PDO）的建立与维持，适配人类肿瘤手术切除标本、患者源性异种移植（PDX）肿瘤标本的类器官培养，实现手术标本培养成功率60%-80%、PDX标本成功率超90%的高效培养效果。

1. 肿瘤组织处理

核心是高效解离组织并保证细胞活性，全程把控操作力度与消化时间：

1.1 新鲜肿瘤组织加1.0-3.0 mL重悬培养基（DMEM+1.0%青霉素-链霉素 + 1.0% BSA），剪碎为0.5-1.0 mm碎片，宽口移液枪转移至离心管，1500 rpm 室温离心5分钟，小心去上清。

1.2 加2.0 mL消化培养基（DMEM+1:100胶原酶（40507ES、40508ES、40509ES、40510ES、40511ES） / 分散酶 + 1.0%青霉素-链霉素）重悬，37℃孵育≤30分钟，至组织块周围出现粉/紫色晕圈即终止。

1.3 重悬培养基终止消化，经250 μm组织筛过滤，滤液1500 rpm室温离心5分钟收集细胞沉淀。

1.4 150 μL Matrigel基质胶包被12孔板单孔，37℃固化；细胞沉淀用含5% Matrigel的完全培养基（DMEM+全套生长因子鸡尾酒（含FGF2/FGF10、EGF、HGF等生长因子及胰岛素、Trolox等小分子调节剂），临用前加5% Matrigel，避免基质胶沉降）重悬，滴加至包被孔，37℃静置培养。

2. 类器官维持与传代

2.1 日常维持：每3-4天滴加更换新鲜完全培养基（临配加5% Matrigel），避免扰动类器官；每4天拍摄图像，评估生长速率。

2.2 传代时机：生长停滞超4天即传代，快生株系12-14天、慢生株系适当延长。

2.3 传代操作：吸除旧培养基，每孔加0.5 mL消化培养基，37℃孵育1.5小时至 Matrigel 解离；加Accutase解离液37℃孵育20-30分钟，进一步解离细胞。

2.4 重铺板：按1:2-1:4传代（早期建议1:2），以50,000-150,000个细胞/孔的密度，接种至新Matrigel包被孔，快生株系降低密度、慢生株系提高密度。

3. 类器官冻存与质控

3.1 冻存操作：细胞沉淀用冻存培养基（Cryostar专用冻存液 + 10 μM ROCK抑制剂Y-27632（Cat# 53006ES或52604ES））重悬，调整密度200,000个细胞/mL，每管500 μL分装；-80℃过夜，24小时内转移至液氮罐长期保存。

3.2 全程质控：解冻后类器官仅限P20代前使用；制备Histogel组织块做免疫组化，验证肿瘤标志物表达；所有操作设平行孔，做好浓度校准与参数记录。

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参考文献

[1] Protocol For Establishment and Maintenance of Prostate Tumor Derived Organoids