实验所用产品

产品货号	产品名称
40186ES	Ceturegel®基质胶(GFR/不含酚红/不含LDEV)(同康宁matrigel胶)

 

一、实验前准备与基质胶铺板

细胞来源：所用细胞为第5代HUVEC（非原代），购自中科院细胞典藏中心。

基质胶解冻与耗材预冷：实验前一天，将基质胶置于4℃冰箱过夜解冻；同时将实验所需的孔板、枪头置于-20℃冰箱预冷。提前开启制冰机，用铁盒装满碎冰，用保鲜膜封口后，紫外照射20分钟备用。

全程低温操作：所有涉及基质胶的步骤均在冰上操作，使用预冷的耗材。

铺板与聚合：使用预冷枪头，将 30 µL 融化的基质胶垂直滴入24孔板孔底中央（注意不要打完，防止产生气泡）。用1 mL枪头轻轻将胶铺开，注意枪头不要碰触孔壁。将铺胶后的24孔板置于4℃冰箱静置2小时，随后转移至37℃培养箱中固化1小时，使基质胶完全凝固。

二、HUVEC细胞准备与接种

细胞预处理（12孔板铺板与加药）：将HUVEC细胞以每孔1.5×10⁵个的密度接种于12孔板中，过夜培养使细胞贴壁。

弃去原培养基，更换为含2%血清的完全培养基，同时加入相应药物，进行饥饿处理12小时（具体时间可根据药物毒性进行预实验调整）。

细胞消化与计数：药物处理结束后，消化细胞，离心后获得细胞沉淀，用含生长因子的完全培养基重悬，并进行精确计数。

细胞接种：待24孔板中基质胶完全凝固后，小心吸弃孔内可能存在的液体。调整细胞密度，以每孔 500 µL 完全培养基（含生长因子）的体积，接种 9-12×10⁴个 细胞（即9万至12万细胞/孔）于凝胶表面。

接种后，轻轻撞击孔板四周使细胞分布均匀。

三、培养、观察与表型记录

孵育：将接种细胞的24孔板置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。

动态观察与记录：从接种后开始，每隔1小时在倒置显微镜下观察一次。成管最佳时间因实验条件而异，根据您的经验，3小时可见最佳管状结构形成，4小时后网络开始出现少许塌陷。应详细记录细胞贴壁伸展、管状连接形成及网络成熟等关键时间点的形态学变化。

四、实验结果

图1：明场显微镜图像	图2：荧光染色结果

（数据来源：中国科学院长春应用化学研究所）

 

血管生成实验小贴士

细胞状态：推荐使用3-5代细胞，可进行血清饥饿同步化；

基质胶：全程冰上操作，铺胶轻柔均匀；
细胞接种：使用单细胞悬液，并精确计数，轻柔加样；

观察：建议通过预实验确定最佳观察时间点，以捕获网络成熟期。