实验所用产品

产品货号	产品名称
40186ES	Ceturegel®基质胶(GFR/不含酚红/不含LDEV)(同康宁matrigel胶)

 

一、实验前准备与基质胶铺板

基质胶解冻与耗材预冷：提前将Ceturegel®基质胶从-20℃冰箱取出，置于冰上，放入4℃冰箱过夜解冻。同时将24孔板、10 μL和200 μL枪头、冰盒等放入-20℃预冷。

全程低温操作：所有涉及基质胶的步骤均在冰上进行。将完全解冻的基质胶置于冰上，轻轻翻转混匀。

基质胶稀释与铺板：使用预冷枪头，用DMEM基础培养基按1:1体积比稀释基质胶，混合均匀。在预冷的24孔板中，孔间隙加入PBS，防止胶体在后续孵育过程中干裂。向每孔中央垂直滴加20 μL稀释后的基质胶原液。用200 μL枪头轻轻推动胶滴使其均匀分布（不用摊太开，后续4℃过夜会自然流平）。

预处理与固化：将铺胶后的24孔板装入密封袋，平放于4℃冰箱过夜，使胶体自然流平。次日取出孔板，转移至37℃培养箱中孵育30分钟，使基质胶完全凝固。

二、HUVEC细胞准备与接种

细胞状态：使用第3-5代HUVEC细胞，培养至24小时内达到80%左右融合度。

细胞饥饿处理：将完全培养液更换为含0.2% FBS的DMEM培养液，继续培养24小时，使细胞周期同步化。

细胞药物预处理：饥饿处理结束后，根据实验设计，对细胞进行药物预处理6-8小时。

细胞消化与重悬：药物处理结束后，消化细胞，离心收集。使用含对应药物的完全培养基重悬细胞，进行精确计数。调整细胞浓度至2.0×10⁵个/mL（即20万细胞/毫升）。

细胞接种：待基质胶完全凝固后，小心吸弃孔内可能存在的液体。向每孔凝胶表面加入500 μL细胞悬液，即每孔接种1.0×10⁵个细胞（10万细胞/孔）。轻轻晃动孔板使细胞分布均匀。

三、培养、观察与表型记录

孵育：将接种细胞的24孔板置于37℃、5% CO₂、90%湿度的培养箱中培养。

动态观察：在接种后的0、2、4、6、8、9、12小时等时间点，使用倒置显微镜观察并拍照记录。具体成管最佳时间可通过预实验进行摸索，一般3-12小时可见血管网络形成，成管时间与细胞状态密切相关。应详细记录细胞贴壁伸展、管状网络形成及成熟等关键形态学变化的时间点。

四、实验结果

图1：明场显微镜图像	图2：荧光染色结果

（数据来源：大连理工大学）

 

血管生成实验小贴士

细胞状态：推荐使用3-5代细胞，可进行血清饥饿同步化；

基质胶：全程冰上操作，铺胶轻柔均匀；
细胞接种：使用单细胞悬液，并精确计数，轻柔加样；

观察：建议通过预实验确定最佳观察时间点，以捕获网络成熟期。