视网膜是中枢神经系统的重要组成部分，负责光信号的接收与初步处理。由于其结构复杂且再生能力有限，视网膜相关疾病如视网膜色素变性、青光眼等常导致不可逆的视力丧失。近年来，基于人源多能干细胞（hPSCs）的三维视网膜类器官技术取得了突破性进展，为研究人类视网膜发育、疾病机制、药物筛选及细胞替代治疗提供了前所未有的平台。

视网膜类器官能够模拟体内视网膜的时空发育过程，自发形成分层结构，包含视网膜神经节细胞、光感受器、双极细胞和Müller胶质细胞等多种细胞类型，并展现出光响应功能。人源多能干细胞形成成熟功能性光感受器周期长，且存在产量低、批次异质性大等挑战。这些因素限制了该技术的标准化应用和规模化生产。

 

培养方案

我们基于 Jason S. Meyer研究团队发表的文章，整理了从人多能干细胞（hPSCs）分化视网膜类器官的培养方案[1]。

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图1 视网膜类器官分化方案概述[1]

1. hPSC复苏与传代：从液氮中取出细胞，37°C水浴快速解冻。将细胞悬液逐滴加入9 mL mTeSR1中，2000 rpm离心3分钟。弃上清，用500 μL mTeSR1培养基重悬，接种于Matrigel包被的6孔板中。轻晃板子使细胞均匀分布，37°C培养。

2. 诱导分化准备：细胞达80%融合度时（通常4-6天）， 吸去培养基，每孔加1 mL预热Dispase，37°C孵育8–12分钟，直至细胞边缘卷曲。吸去Dispase，每孔加1 mL DMEM/F12轻轻洗涤。用2 mL DMEM/F12强力吹打，收集至15 mL离心管。重力沉降后弃上清，用3:1的mTeSR1:NIM培养基重悬，转移至T75培养瓶，总液体12 mL。

NIM培养基配方（500mL）

 

3. 培养基过渡：按如下所示梯度替换培养基
Day 0，mTeSR1:NIM = 3:1；

Day 1，mTeSR1:NIM = 1:1；

Day2，mTeSR1:NIM = 1:3；

Day3，100% NIM，完全切换至神经诱导培养基；

Day4，更换新鲜NIM，加入BMP4至终浓度1.5 nM。

4. 贴板培养与视网膜分化：Day8，收集聚集体于15 mL离心管，静置沉降。6孔板每孔加500 μL FBS，随后每孔加入2 mL聚集体悬液（含BMP4培养基），轻晃均匀。37°C培养24小时。Day9，每孔吸1 mL培养基，加1 mL新鲜NIM（无FBS）。Day 12，重复半量换液；Day15完全换液 NIM，吸去全部旧培养基。

5. 类器官形成：用1000μl枪头轻柔刮下贴壁的聚集体。收集至15 mL离心管，静置沉降。弃上清，用5 mL RDM培养基重悬。转移至低吸附60 mm培养皿中，37°C悬浮培养。37°C培养，每2-3天换液。剥离后聚集体应自发组装成3D结构，Day 20左右形成明显的optic cup形态。

RDM培养基配方（500mL）

成分	用量
DMEM/F12	240 mL
DMEM	240 mL
B27添加剂	10 mL
青霉素-链霉素	5 mL
MEM NEAA	5 mL

6. 长期培养及维持：每2-3天换液一次。Day20-Day24逐步增加FBS（1%，3%，5%）的比例。Day26，更换培养基为RDM + 10% FBS + 1× GlutaMAX。Day35，上述培养基添加100 μM 牛磺酸。Day 60，在上述培养基再额外添加1 μM 视黄酸。Day90,换为RMM培养基维持长期培养。

RNM培养基配方（500mL）

成分	用量
DMEM/F12	215 mL
DMEM	215 mL
B27添加剂	10 mL
青霉素-链霉素	5 mL
MEM NEAA	5 mL
FBS（40131ES或40132ES）	50 mL
GlutaMAX（100×）	5 mL
牛磺酸（100mM）	500 μL

 

图2 视网膜类器官层随时间的分层[1]

 

2024年，Meyer研究团队基于上述经典培养方法，进一步建立了一种高效、可重复的视网膜类器官分化方法[2]。该方法通过单细胞重聚和BMP信号调控，实现了100%的视网膜分化效率，显著提高了类器官大小和形状的一致性，有效解决了传统方法中批次异质性大的技术瓶颈。

图3 传统方法与标准方法的差别图示[2]

 

随着培养技术的不断优化和标准化，人视网膜类器官必将在眼科基础研究、药物开发和临床应用中发挥越来越重要的作用，为最终解决视网膜退行性疾病的治疗难题带来新的希望。

 

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Ø 参考文献

[1] Fligor CM, Huang KC, Lavekar SS, et al. (2020). Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells. Methods in Cell Biology, 159:279-302.

[2]Harkin J, Peña KH, Gomes C, et al. (2024). A highly reproducible and efficient method for retinal organoid differentiation from human pluripotent stem cells. PNAS, 121(25):e2317285121.

（本文中的实验方案基于已发表文献优化整理，内容仅供参考，实际实验条件可能因细胞系差异、实验室环境等因素需调整，建议用户在正式实验前进行预实验优化。）