研究背景

人B细胞活化因子（BAFF），又名B细胞刺激因子（BLyS）、CD257、TALL-1和TNFSF13B等，属肿瘤坏死因子（TNF）超家族成员，其主要由单核细胞、树突状细胞及T细胞产生，可以表达为同源三聚体或与相关蛋白APRIL相关的异聚体，在促进B细胞激活、增殖和分化，及免疫应答中起重要作用。BAFF水平不足将无法激活B细胞产生足够的免疫球蛋白，并导致免疫缺陷。BAFF水平过高会导致异常高的抗体产生，导致系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和许多其他自身免疫性疾病。BAFF在包括单核细胞、树突状细胞和骨髓基质细胞在内的各种细胞类型上表达为膜结合II型跨膜蛋白，蛋白酶可使之水解而转变为可溶性BAFF。

产品描述

翌圣Human BAFF/BLys/TNFSF13B ELISA(酶联免疫吸附测定)试剂盒是一种体外酶联免疫吸附测定试剂盒，用于定量测定血清、血浆和细胞培养上清中的人B细胞活化因子(Human BAFF/BLys/TNFSF13B)。特异性抗人B细胞活化因子抗体预包被在高亲和力的酶标板上。酶标板孔中加入标准品、待测样本，经过孵育，样本中存在的人B细胞活化因子与固相抗体结合。洗涤去除未结合的物质后，加入检测抗体孵育结合，经洗涤，再加入酶结合物(Streptavidin-HRP)孵育结合。洗涤后，加入显色底物 TMB，避光显色。颜色反应的深浅与样本中人B细胞活化因子的浓度成正比。加入终止液终止反应，在450 nm 波长(参考波长570 - 630 nm)测定吸光度值。

试剂盒组分

表1.试剂盒组分表

运输与保存方法

试剂盒可全置于4℃ 贮存，也可按照表1将试剂依据要求存放，避免污染与反复冻融，稀释成工作浓度试剂即用即弃，不可重复使用。

表2.首次使用后试剂保存表

注意事项

1、试剂盒需在保质期内使用完毕。禁止不同批次的相关试剂进行混用。

2、本产品仅能够应用于检测说明书中标注的靶点抗原与样本。其它应用需经使用者设计验证后，根据结果评估使用的可靠性与准确性。

3、本产品仅用于研究，不能用于临床诊断或治疗。

4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5、不要混合或替代其他试剂盒批次的试剂或材料的供应商。

常见技术提示

1. 生成高于最高标准的值时，样本应在适当的样品稀释缓冲液中进一步稀释。
2. 混合或重组时避免产生泡沫。
3. 在添加标准品、样本和其他加量时，要及时更换枪头，避免交叉污染。
4. 在孵育期间，保证酶标板适当密封或封板膜覆盖完全。
5. 请在清洗步骤中完全清除所有溶液和缓冲液。
6. 在溶解标准品之前，请勿将标准品管随意倒置。当将标准品管倒置后，加入缓冲液后请充分上下混匀，然后低速离心。
7. 在实验过程中，所有的试剂应放置在冰盒上放置，试剂盒按照说明书要求放置。
8. 在实验完成后及时丢弃缓冲液，即用即弃。
9. 不同产品的试剂盒组分不同，不可交叉使用。

其他准备材料

这些材料不包括在工具包中，准备利于后续实验分析的工具: 

1、酶标仪，在450 nm测量吸光度(参考波长630 nm)。

2、恒温箱，水平振荡器和自动微孔洗板机。

3、精密移液器，1 μL到1mL移液枪与配套枪头。

4、100毫升和1升刻度量筒。

5、标准品或样品稀释试管。

6、吸水纸。  

7、蒸馏水或去离子水。

8、计算机及软件分析。

实验前准备

1.样本收集与处理

1) 细胞培养上清：1,000×g离心10分钟去除沉淀物，即刻检测，或者分装，-20℃以下贮存。

2) 血清样本：使用不含热原和内毒素的试管收集血清。血样凝集30分钟后，1,000×g离心10分钟。吸取血清样本之后即刻检测，或者分装，-20℃以下贮存。

3) 血浆样本：EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝收集血浆样本。1,000×g离心30分钟收集样本。即刻检测，或者分装，-20℃以下贮存。

本试剂盒可能适用于其它生物学样本。细胞培养上清、血清和血浆已经过验证。

注意：检测前，样本中可见的沉淀必须去除。不要使用严重溶血或高血脂的样本。样本应分装并贮存于-20℃，以避免人B细胞活化因子活性的丢失。如果在24小时内检测，样本可以存放在2-8℃，避免样本的反复冻融。在检测前，冷冻样本应缓慢地恢复至室温(25℃土3℃)，轻柔地混匀。

如果样本需要稀释，请使用指定的样本缓冲液进行稀释。

建议正常的血清/血浆样本(仅供参考）：5倍（使用1×样品稀释液）

参考步骤：取100μL血清/血浆样本加入400μL 样品稀释液（1：5已稀释）充分混匀即为5倍稀释。

建议低蛋白细胞培养上清(仅供参考）：原液

因样本所含有目标蛋白的含量有差异，每个样本的稀释比例建议根据预实验结果或按实际情况判定。

2.酶标板准备

酶标板在使用之前需恢复室温。 未使用的板条应及时放入干燥剂密封后储存在4°C，建议每个样本复孔实验。

3.试剂准备

使用前所有试剂组分以及待测样本需要恢复室温。为了保证实验的准确性，请在使用前15分钟内完成。

1. 1 ×洗液 配制：浓缩液平衡至室温，充分溶解，不要有结晶。混匀，取25 mL 20×洗液至超纯水中，然后定容到500mL；具体配制体积，可按照每次使用量进行配制。
2. 1 ×样品稀释液 配制：浓缩液平衡至室温，充分溶解，不要有结晶。混匀，取10 mL 5×样品稀释液至超纯水中，然后定容到50mL；具体配制体积，可按照每次使用量进行配制。样品稀释液用来稀释标准品和待测样品。
3. 检测抗体 配制：取一支检测抗体冻干品用超纯水按标签标示量溶解，充分混匀，10000rpm离心20秒，然后全部吸出定容至6mL 抗体稀释液；具体配制体积，可按照比例每次使用量进行配制，充分混匀。
4. 酶结合物 配制：使用前10000rpm离心20秒，然后用酶稀释液以1：200稀释至工作浓度使用，可一次吸取30 μL定容至6 mL 酶稀释液；具体配制体积，可按照每次使用量进行配制，充分混匀。
5. 标准品曲线的制备：准备7个无菌的1.5mL离心管，按照标准品浓度依次进行标记。S1制备：取一支标准冻干品用超纯水按标签标示量溶解，充分混匀，即标记其为2500 pg/mL。各离心管分别加入500μL 1 ×样品稀释液，先取500μL S1，加至第一个离心管中充分混匀后，再取500μL至下一个标记浓度的离心管中，充分混匀，进行一列2倍梯度稀释标品，起始最高浓度标记2500 pg/mL，最低浓度为39 pg/mL，可按照下面的配制方法来进行。每次试验均需制备相应的标准曲线，不同试剂盒以及不同时间的标准曲线不能混用。样本测试时，每个孔所需标品量为100μL，注意配制体积要高于所需体积，避免体积使用量不足。

表3 人B细胞活化因子(Human BAFF/BLys/TNFSF13B) 标准品体系配制（39-2500 pg/mL）

实验方法

使用前所有试剂组分以及待测样本需要恢复室温。强烈建议所有的标准品和待检样本进行双复孔测定。

1.试剂准备：备好各种待测试剂、稀释好的标准品和待测样本。

2.标条确定：计算待测样本和标准品所需酶标条，将酶标条从铝箔袋取出，剩余酶标条放回铝箔袋中并封好袋口，低温保存。

2.灵敏度检测

人B细胞活化因子的最低检测限为3.7 pg/mL，通过使用重复检测20次零孔OD值的均值与标准差计算得出。

3.精密度检测

酶标板内精密度

3个已知浓度的样本酶标板内重复测定10次，评估酶标板内的精密度。

酶标板间精密度

3个已知浓度的样本酶标板间重复检测24次，评估酶标板间的精密度。

4.回收率检测

 通过不同水平的人B细胞活化因子添加于样本中来测定回收率，其回收率如下:

5.稀释线性检测

6.样本值

应用本试剂盒，检测若干健康志愿者的样本，志愿者的用药史不详。

n.d. 指样本浓度值低于检测范围内的3.9 pg/mL

7.测定特异性

本试剂盒识别天然和重组人B细胞活化因子。下述因子进行了特异性的评估，没有观察到明显的交叉反应和干扰影响。