植物叶片RRBS建库全流程指南

2026-10-20

一、RRBS是什么？

RRBS（Reduced Representation Bisulfite Sequencing）简化代表性亚硫酸氢盐测序，是一种低成本、高性价比、单碱基分辨率的 DNA 甲基化测序方法，专门富集并检测基因组上CpG 高密度区域（启动子、CpG 岛等）的甲基化状态。

其原理是用MspI 酶（识别 CCGG，不受甲基化影响）切基因组，只保留含大量 CpG 的短片段（主要是启动子/ CpG 岛）；再做亚硫酸氢盐转化（未甲基化 C碱基变成G碱基，甲基化修饰的C碱基不变）；最后建库测序，由此计算每个 CpG 的甲基化率。

二、为什么植物甲基化研究常用RRBS？

哺乳动物基因组的CpG分布相对集中，而植物基因组中MspI（CCGG）位点分布与哺乳动物差异显著——大量测序数据会浪费在重复序列区。同时，植物广泛存在CG、CHG和CHH三种甲基化（CHH依赖RdDM途径维持）。

RRBS通过MspI酶切聚焦CpG富集区，以较低成本获得高覆盖度CpG甲基化信息。

除了单酶切外，还可以搭配其他酶来增加基因组的覆盖度，其他常见的甲基化不敏感酶包括：HpyCH4V, AluI, BstNI, HaeIII, HpyCH4III,ApeKI, BanII, BglII, TaqαI, SphI, BamHI, BssSI and KpnI。

三、植物叶片的特殊挑战

1、多糖类干扰：

细胞内大量多糖与DNA共沉淀，抑制MspI酶活性。建议：2×CTAB缓冲液（含1% PVP和0.2% β-巯基乙醇）提取，β-巯基乙醇需新鲜配制抑制多酚氧化。

2、多酚类化合物：

氧化为醌类与DNA不可逆交联。建议：高PVP浓度CTAB缓冲液处理。

3、叶绿体DNA污染：

叶绿体在叶肉细胞中含量丰富，每个叶绿体基因组约120-180 kb。可通过生物信息学过滤比对至叶绿体基因组参考序列去除。

四、RRBS常规建库流程

1、酶切：

MspI（推荐）或ApeKI（对CG甲基化不敏感，替代方案），37℃ 3-4小时。植物基因组含修饰碱基较多，酶切时间需适当延长。

2、末端修复+加A+甲基化接头连接：

使用含5mC修饰的甲基化接头，16℃过夜连接。

3、片段筛选：

2%凝胶切胶回收300-500 bp，或Ampure XP磁珠双轮筛选（0.8x去除大片段→0.2x富集目标片段）。

4、亚硫酸氢盐转化：

同WGBS，98℃ 10分钟→64℃ 2.5小时。

5、PCR富集：

12-14个循环（植物RRBS片段通常较小，建议循环数略高于动物方案）。

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核酸提取		18529ES	MolPure® Mag Plant DNA Kit磁珠法通用植物DNA提取试剂盒
酶切		15064ES	FuniCut® MspI
		15063ES	FuniCut® HpaII
		15078ES	FuniCut® AluI
		15217ES	Nt.BstNBI (10 U/μL)
		15067ES	FuniCut® HaeIII
		15225ES	ApeKI (10 U/μL)
		15049ES	FuniCut® BglII
		15029ES	FuniCut® SphI
		15003ES	FuniCut® BamHI
		15015ES	FuniCut® KpnI
转化	盐转	12225ES	Hieff® Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit	超快速柱法
	盐转	12224ES	Hieff® DNA Methylation Bisulfite Kit	柱法，液态转化剂
	盐转	12222ES	Hieff® DNA Bisulfite Conversion Kit	柱法，固态转化剂
	盐砖	12227ES	Hieff® Mag Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit	超快速磁珠法
	盐转	12223ES	Hieff® Mag DNA Methylation Bisulfite Kit	磁珠法
	酶转	12213ES	Hieff® DNA Enzymatic methyl- Conversion Kit	EM-seq
	酶转	12212ES	Recombinant Ten-Eleven Translocase 2.0(TET2.0, with buffer)	TAPS
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建库	双链建库	12214ES	Hieff NGS® dsDNA Methyl Library Prep Kit for Illumina®
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	环化	13340ES	Hieff NGS® Dual Barcode Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI/双端barcode MGI环化试剂	环化试剂
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