动物组织样本的RRBS建库全流程指南

2026-10-20

导读

RRBS（Reduced Representation Bisulfite Sequencing，简化代表性重亚硫酸氢盐测序）是一种高效、高性价比的表观遗传研究技术，通过限制性酶切富集CpG富集区域，结合重亚硫酸氢盐转化，实现单碱基分辨率的基因组甲基化图谱分析。本文针对动物组织样本，简单阐述RRBS建库的完整流程、质控标准，助力研究者规范实验流程、提高建库成功率。

一、样本处理与基因组DNA提取

新鲜组织：

取适量动物组织，用无菌生理盐水冲洗干净，去除血液、脂肪等杂质，置于无菌离心管中，加入液氮快速冷冻，用组织研磨仪破碎至粉末状（避免组织融化导致DNA降解）。

冻存组织：

从-80℃冰箱取出样本，无需解冻，直接加入液氮研磨破碎，避免反复冻融。

二、基因组DNA提取

提取的基因组DNA需进行浓度、纯度、完整性检测，不合格样本需重新提取或处理，具体标准如下：

浓度质控：

Qubit荧光定量仪检测，浓度≥20ng/μL，体积≥20μL，起始量建议1-5ug投入（低质量样本可适当调整）。

纯度质控：

Nanodrop检测，A260/A280=1.8~2.0（符合基因组DNA纯度标准），A260/A230≥1.5。

三、RRBS建库

酶切与片段选择

目的是通过MspI酶切富集CpG富集区域，筛选合适大小的DNA片段，为后续甲基化检测奠定基础，可采用单酶切（MspI）或双酶切（MspI+HpaII），常规选用单酶切即可。

重亚硫酸氢盐转化

目的是将DNA中未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），甲基化的胞嘧啶（5mC）保持不变，这是RRBS检测甲基化的核心原理，需严格按照试剂盒说明书操作，避免转化不彻底影响实验结果。

末端修复与加A尾

转化后的DNA片段末端存在缺口和羟基，需进行末端修复（补平缺口）并在3’端加A尾，为后续接头连接做准备，可将两个步骤合并进行，提高实验效率。

甲基化接头连接

连接甲基化接头（含样本特异标签，用于区分不同样本），接头需经过甲基化修饰，防止自身在重亚硫酸氢盐转化中被修饰，避免影响测序结果。注意：接头用量需严格控制，避免接头过量导致接头二聚体产生，影响后续PCR扩增。

PCR扩增与纯化

目的是扩增连接接头后的DNA片段，获得足够量的文库，PCR扩增需选用高保真、尿嘧啶耐受型聚合酶，减少扩增偏差，同时控制循环数，避免过度扩增导致的碱基偏好性。

四、文库质控

文库质控是确保测序质量的关键，需从浓度、片段大小、纯度三个维度检测，只有质控合格的文库才能进行后续测序，具体标准如下：

浓度质控：

Qubit荧光定量仪检测，文库浓度满足上机测序要求。

片段质控：

Agilent 2100生物分析仪检测，文库片段大小满足上机测序需求，无明显杂峰，无接头二聚体。

五、上机测序与数据分析

将文库进行上机测序，等测序结果导出后进行数据分析流程，RRBS数据质控：重亚硫酸盐转换率＞99%（基本质控）；酶切效率＞95%（非常重要）。

RRBS数据分析的核心是挖掘甲基化位点信息，分析甲基化分布规律及差异甲基化区域（DMR），结合功能分析揭示表观遗传调控机制。

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