Hieff® HC Fast Tagmentase

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Hieff® HC Fast Tagmentase（10 U/μL，2.2 μg/μL）是野生型Tn5转座酶的突变形式，可识别 Tn5 转座子酶序列的内端(inside end, IE）、外端(outsideend, OE)和嵌合端(mosaic end, ME)序列，含有ME序列片段的转座效率最高。

该产品为高浓度的Tn5裸酶，进行接头包埋后，可高效、随机的将Tn5 转座子插入到目标序列，被广泛应用于体外转基因和二代测序建库等领域。

产品特色

高酶活浓度。
野生型Tn5酶。
可兼容不同的包埋序列。
应用方向：DNA建库、ATAC建库、细菌突变体库、甲基化、单细胞基因组、三代基因组等方法。

应用案例

转座酶应用，有针对测序和微生物突变体文库构建

方案一：以高通量测序建库为例，在使用前，请务必仔细阅读使用说明。

1. 接头制备

1）Illumina平台参考引物名称及序列：

Primer A：5'-phos-CTGTCTCTTATACACATCT-NH₂-3'

Primer B：5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3′

Primer C：5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3′

2）使用Annealing Buffer溶解Primer A、Primer B、Primer C至100 μM。

3）分别配制如下反应体系：

组分	反应1
Primer A（100 μM）	10 μL
Primer B（100 μM）	10 μL
total	20 μL

组分	反应2
Primer A（100 μM）	10 μL
Primer C（100 μM）	10 μL
total	20 μL

4）分别将反应1和反应2涡旋振荡充分混匀，并短暂离心使溶液回到管底。置于PCR仪内，进行如下反应程序：热盖105℃ On，94℃加热2 min。时间到后，立即停止反应程序（一定不要超过反应时间，最好设置一个计时器提醒），不要打开PCR仪盖子，直接让反应管在PCR仪器中自然冷却2 hour，然后再于4℃或冰上冷却5 min。

或者设置PCR程序：热盖105℃ On；72℃ 15 min；60℃ 10 min；50℃ 10 min；40℃ 10 min；25℃ 30 min。

5）反应结束后，将反应1和反应2等体积混合，混匀。命名为Adapter Mix，-25~-15℃保存。

2．转座子生成

1）配置以下反应体系：

组分	体积（μL）
HC Fast Tagmentase（10 U/μL，2.2 μg/μL）	10
Adapter mix (25 μM)*	8
Assemble Buffer	Up to 200

*Adapter mix根据实验目的以及测序平台，自备。

2）反应条件：使用移液器轻轻吹打充分混匀。置于25℃反应1 h（热盖关闭）。反应产物命名为Tn5 Mix，可直接应用于建库实验，或-25~-15℃保存。

3．DNA片段化测试

1）配置以下反应体系：

组分	体积（μL）
Input DNA (50 ng/μL)	1*
5 × Reaction buffer	4
Tn5 Mix	2**
ddH2O	Up to 20

*DNA 使用量越大，片段化产物平均长度越长；反之，片段化产物平均长度越短。

**如需提高打断程度，可提高Tn5 Mix使用量；反之，可减少酶使用量。

2）片段化反应程序

轻轻吹打或振荡混匀，短暂离心。按照下表所示反应程序，进行片段化反应。

温度	时间
热盖105℃	On
55°C	10 min
4°C	Hold

3）DNA片段化终止

配置以下反应体系，在上述片段化产物中添加下表中各反应组分，使用移液器轻轻吹打20次混匀。

组分	体积（μL）
片段化产物	20
6×Terminate Solution	4
Total	24

按照下表所示反应程序，进行终止反应。

温度	时间
热盖105℃	On
55°C	10 min
4°C	Hold

待样品温度降到4°C后，取出PCR管，进行片段化产物纯化，可以选择1.2×磁珠纯化，推荐使用Hieff NGS® DNA Selection Beads（Cat#12601ES），最终使用21 μL ddH₂O洗脱片段化产物。

4）质量控制

a. 使用 Qubit 进行浓度测定。

b. 使用 Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer 进行长度分布检测。

5）片段化产物扩增

可根据具体的实验目的与测序平台选择合适的试剂进行扩增实验。

方案二：微生物突变体文库构建

步骤1：转座子准备：

a. Tn5转座子的设计。Tn5转座子是两侧带有19bp ME序列的DNA片段，可以使用含有ME序列的上下游引物进行PCR合成。为了获得最佳的转座效率，在两端的PCR引物中需要添加一个5'磷酸基团。
典型的Tn5转座子参考图1。
ME序列：5'-[phos]CTGTCTCTTATACACATCT-3'

得到的转座子的正义链序列：
5'-CTGTCTCTTATACACATCT+目的基因（抗性标记）+AGATGTGTATAAGAGACAG-3'

图1：Tn5转座子示意图。Tn5转座子其两端为19bp ME序列，ME序列可被Tn5转座酶特异性识别。

b. 按照下表依次加入相应试剂，制备Tn5转座体复合物。

成分	用量
Tn5 Transposon DNA(100 μg/mL in TE Buffer，步骤2a)	2 μL
Tn5转座酶(40 μM)	4 μL
Glycerol(100%,714419ES)	2 μL
总反应体积	8 μL

· 本反应无须Mg²⁺催化，请勿使用5×Reaction Buffer。

· 参考a中Tn5的转座子设计，Tn5 Transposon DNA为含选择标记(如抗性标记)、成对识别序列(如ME序列)和目标基因的双链DNA，可通过PCR等方法获得。

· 本反应体系可根据实际需要进行放大或缩小。

c. 混匀后室温孵育0.5～1 hour。

d. 取1 μL的转座体复合物电击转化到感受态细胞中，在体内进行插入，并根据抗性标记筛选阳性菌株。推荐的电击转化条件：50 μL感受态细胞，1 μL转座体复合物，2毫米电击杯，2500 V，电击时间5毫秒。转化条件可根据该条件的转化效果进行优化。转座的克隆数主要取决于所转化的宿主细胞、内源性的限制修饰系统及感受态细胞的转化效率。

e. 构建好的转座体复合物-20℃可以保存1年。