在中心法则的经典叙事中，DNA序列决定了生命的蓝图。然而，真正决定一个细胞是变成肝细胞还是神经元的，除了序列本身，还有一套隐藏在序列之上的“第二套密码”——表观遗传修饰。

其中，DNA甲基化是最常见、研究最深入的表观遗传修饰形式。它如同基因的“开关”，在不改变DNA一级结构的情况下，精细调控着基因的表达 。从胚胎发育、细胞分化，到癌症发生、衰老进程，DNA甲基化无处不在。

随着二代测序（NGS）技术的普及，全基因组甲基化测序（WGBS）已成为解析这“第二套密码”的黄金手段。今天，我们就从产品经理的视角，带您深入了解DNA甲基化测序的技术原理、应用场景，以及如何应对实验中遇到的“疑难样本”挑战。

一、 背景介绍：什么是DNA甲基化，我们为何要研究它？

DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上，在DNA甲基转移酶的作用下，形成5-甲基胞嘧啶 (5mC) 。在人类基因组中，约70%~80%的CpG位点存在甲基化修饰 。

这些CpG位点在基因组中分布并不均匀，常常聚集形成“CpG岛”（CpG islands），主要位于基因的启动子区域 。通常情况下，启动子区域的CpG岛处于非甲基化状态，允许基因转录；而在肿瘤细胞中，抑癌基因启动子区域的CpG岛往往发生高度甲基化，导致转录沉默，进而推动癌症的发生发展。

图1 DNA 甲基化调控基因表达的示意图（图源网络 侵删）

因此，DNA甲基化研究不仅是基础科研的热点，更在临床转化中展现出巨大潜力：

1. 早期诊断：在影像学发现病灶前，血液中循环肿瘤DNA（ctDNA）的甲基化改变即可提示肿瘤风险 。
2. 疗效监测：动态监测特定基因的甲基化水平，可用于评估治疗反应和微小残留病灶。
3. 法医鉴定：利用组织特异性甲基化模式，可进行体液溯源和年龄推断。

二、 技术应用：甲基化测序的三大研究方向

1、全基因组甲基化测序（WGBS）—— 绘制甲基化图谱的“金标准”

WGBS利用亚硫酸氢盐（Bisulfite）处理DNA，将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），而甲基化的C保持不变。结合NGS测序，我们可以在单碱基分辨率下，绘制全基因组的甲基化图谱 。这种“无差别扫描”的方式，适用于发掘全新的甲基化标志物，如早期胚胎发育机制研究、大规模队列的肿瘤标志物筛查 。

图2  DNA甲基化基本原理示意图(来源：Public Library of Bioinformatics)

2、靶向甲基化测序—— 临床转化的“高效工具”

当研究焦点集中在特定基因Panel（如抑癌基因启动子）时，靶向甲基化测序是更经济的选择。通过先进行Bisulfite转化，再对目标区域进行PCR扩增或杂交捕获，可以极低的成本实现高测序深度，非常适合大样本验证和液体活检中低丰度ctDNA的检测 。

3、单细胞/微量样本甲基化测序—— 破解“疑难样本”的利器

常规甲基化建库需要微克级的DNA。但对于受精卵、循环肿瘤细胞或激光显微切割的病理切片等“微量”样本，传统方法束手无策。单链DNA建库技术的出现解决了这一痛点。它专门针对Bisulfite处理后断裂、受损的单链DNA进行高效连接和回收，使得低至10 pg的起始量也能完成高质量的甲基化文库构建 。

图3 单细胞甲基化测序实验流程（图源网络 侵删）

三、 常见实验方案（NGS甲基化检测工作流）

在开展DNA甲基化测序项目时，根据样本类型和起始量，通常遵循以下两种技术路径：

路径A：常规样本（如组织、细胞系）双链建库方案

1. DNA提取与质检：确保DNA总量≥500 ng，无明显降解。
2. 片段化：使用超声或酶切将DNA打断至200-300 bp。
3. 末端修复与加A：对双链DNA进行末端修复并加A尾。
4. 接头连接：连接甲基化专用接头（保护接头序列免受Bisulfite破坏）。
5. Bisulfite转化：这是核心步骤，使用亚硫酸氢盐处理，将未甲基化C转化为U。这一步会剧烈降解DNA，导致约50%-90%的DNA损失，因此转化试剂的效率和保护能力至关重要 。
6. PCR扩增与文库纯化：引入Index，扩增富集文库。
7. 文库质控与上机测序。

路径B：微量/降解样本（如cfDNA、FFPE）单链建库方案

针对ctDNA、FFPE DNA这类本身量少且片段化严重的样本，传统双链建库会造成大量信息丢失。此时推荐 “先转化，后建库”的单链建库流程 ：

1. DNA提取与直接转化：无需预先片段化，直接对微量DNA进行Bisulfite转化。转化后DNA变成断裂的单链。
2. 单链连接：利用特殊的单链连接酶，将甲基化接头直接连接到单链DNA的两端。这是单链建库的核心，能最大限度保留原始信息。
3. 纯化与二链合成：纯化后通过扩增合成第二链。
4. 文库扩增与质控。

图4  DNA甲基化测序步骤流程（图源网络 侵删）

四、总结：表观遗传时代的“导航仪”

DNA甲基化测序正在重塑精准医疗的格局。它不仅是肿瘤早筛的“火眼金睛”，能比影像学提前数年发现隐患；也是衰老研究的“时光机”，量化生命的进程。

对于IVD企业和实验室而言，构建一套成熟的甲基化检测平台，核心在于解决“转化损伤”与“微量建库”的矛盾。选择高性能的转化试剂、低损耗的建库体系以及精准的靶向富集方案，是打造高灵敏度、高特异性甲基化产品的基石。

翌圣生物凭借在酶工程和建库工艺上的深厚积累，推出了全套DNA甲基化测序解决方案，助力合作伙伴抢占表观遗传检测的万亿蓝海。

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