2026年1月，第四军医大学陈发明团队在生物材料领域顶级期刊 Bioactive Materials（IF=20.3）发表重磅研究“Bioengineered extracellular vesicles escape lysosomal degradation and deliver Tet-PKM2 for macrophage immunometabolic reprogramming and periodontitis treatment”，创新性构建了单宁酸修饰的四聚体PKM2富集型大胞外囊泡（LEVs^Tet-PKM2@TA），成功突破胞内溶酶体降解屏障，通过精准递送代谢酶实现巨噬细胞免疫代谢重塑，在牙周炎模型中取得了显著的炎症消退与组织再生效果。

研究背景

牙周炎是临床高发的慢性炎症性疾病，其核心病理特征是牙周支持组织的进行性破坏，而巨噬细胞极化失衡是驱动疾病进展的关键：促炎M1型巨噬细胞过度浸润，抗炎M2型巨噬细胞功能受抑，最终导致炎症迁延不愈、组织受损。

近年研究证实，代谢重编程是调控巨噬细胞极化的底层机制：M1巨噬细胞依赖糖酵解供能，三羧酸（TCA）循环与氧化磷酸化（OXPHOS）通路受阻；M2巨噬细胞则以完整的TCA循环和高效OXPHOS为代谢特征。

研究团队在临床牙周炎样本中首次证实：炎症状态下，巨噬细胞内四聚体丙酮酸激酶M2（Tet-PKM2）表达显著下调。作为糖酵解通路的终末限速酶，Tet-PKM2具有高酶活性，可推动丙酮酸进入TCA循环；而炎症诱导其解聚为二聚体/单体后，不仅丧失代谢酶活，还会入核促进炎症因子与糖酵解相关基因表达，进一步放大炎症反应。

图1. 牙周炎临床样本的代谢紊乱与Tet-PKM2表达下调

然而，直接递送功能性代谢酶面临两大技术瓶颈：小分子激活剂脱靶风险高，常规胞外囊泡递送系统易被溶酶体降解，生物利用度极低。

研究策略

针对上述痛点，研究团队设计了“活性酶富集+溶酶体逃逸”的双重工程化改造策略，打造出兼具高载药量与高胞质递送效率的LEVs^Tet-PKM2@TA制剂：

 1.富集Tet-PKM2的大胞外囊泡制备

先通过慢病毒转染在HEK293T细胞中过表达PKM2，再用变构激活剂TEPP-46诱导PKM2形成高活性四聚体；

采用差速离心法分离大胞外囊泡（LEVs，直径约218.8nm）。相比小胞外囊泡（SEVs），LEVs拥有更大的内部空间，载蛋白能力更强，更适合递送Tet-PKM2这类大分子功能蛋白。

图2. Tet-PKM2富集型大胞外囊泡的制备与表征

 2.单宁酸（TA）原位修饰实现溶酶体逃逸

利用单宁酸的多酚基团与EV磷脂双分子层的氢键作用，在LEVs表面原位修饰TA。TA具有pH响应特性：当LEVs被巨噬细胞内吞进入溶酶体后，酸性环境会触发TA质子化，通过“质子海绵效应”引发溶酶体肿胀、膜通透性增加，最终帮助囊泡逃离溶酶体降解，将Tet-PKM2释放到胞质中发挥功能。

图3. 单宁酸原位修饰LEVs及其内吞稳定性验证

核心实验发现

 1.TA修饰赋予LEVs强效溶酶体逃逸能力

研究通过多维度实验验证了逃逸效果：

共定位分析显示，LEVs@TA与溶酶体的共定位系数显著低于未修饰LEVs；

钙黄绿素渗漏实验证实，LEVs@TA可破坏溶酶体膜完整性，使内容物扩散至整个胞质；

透射电镜直接观察到溶酶体肿胀、膜断裂等形态变化；

粗粒度分子动力学模拟从原子层面揭示了TA在酸性环境下从EV膜解离、破坏溶酶体稳定性的动态过程。

图4. LEVs@TA的溶酶体逃逸能力：多维度实验验证

 2.体外重塑巨噬细胞代谢，驱动抗炎表型转化

在LPS诱导的炎症巨噬细胞模型中，LEVs^Tet-PKM2@TA展现出强大的代谢重编程与免疫调控能力：

代谢层面：显著提升丙酮酸激酶活性，促进糖酵解中间产物消耗，恢复TCA循环通量，提升OXPHOS水平与ATP产量，逆转炎症导致的线粒体膜电位下降与功能损伤；

图5. LEVs^Tet-PKM2@TA重塑巨噬细胞代谢：糖酵解→TCA→OXPHOS

免疫层面：显著下调IL-6、IL-1β、iNOS等M1型标志物，上调IL-4、Arg-1、CD206等M2型标志物，有效推动巨噬细胞向抗炎修复表型转化。

进一步通过MPC1特异性抑制剂UK-5099阻断丙酮酸进入线粒体后，上述代谢效应被有效抑制，证实其作用机制严格依赖Tet-PKM2介导的丙酮酸-TCA代谢通路。

图6. 代谢重编程驱动的巨噬细胞M1→M2表型转化

3.体内高效治疗牙周炎，促进牙周组织再生

在小鼠结扎诱导牙周炎模型中，局部注射LEVs^Tet-PKM2@TA取得了显著的治疗效果：

提升牙龈组织丙酮酸激酶活性，诱导巨噬细胞向M2型极化，减轻局部炎症细胞浸润；

Micro-CT结果显示，牙槽骨吸收被显著抑制，骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）明显提升；

组织学染色证实，牙周胶原纤维排列更有序，新生组织量显著增加；

安全性评估显示，制剂对心、肝、脾、肺、肾等主要脏器无明显毒性，血清生化指标正常，生物相容性良好。

图7. LEVs^Tet-PKM2@TA体内治疗牙周炎：骨再生与组织修复

翌圣产品助力

本研究中，巨噬细胞极化相关基因、PKM2基因的表达定量是验证免疫调控效应的核心实验环节。研究团队选用翌圣生物反转定量试剂，全程保障实验数据的稳定与精准：

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