microRNA是一类被广泛关注的非编码RNA，长度为22 nt左右，对植物和动物的基因表达有着非常重要的调控作用。本试剂盒采用加A尾法来进行miRNA第一链cDNA的反转录，产品中的2×Hifair^® miRNA RT buffer包含了miRNA加A尾反应和逆转录反应的所有原料和引物，并经过精心优化，可保证miRNA 3'末端的Poly(A)修饰过程和逆转录过程同时高效进行。后续qPCR中只需设计特异性正向引物，配合试剂盒中的通用反向引物，即可对样本中的miRNA进行检测。此外，试剂盒中提供了人、大鼠、小鼠通用的 U6 内参上下游引物，可在宽广的区域内得到良好的标准曲线。

本产品推荐与本公司的Hieff^® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（Cat#11171）配套使用，以获得最优的实验结果。

 

产品组分

组分编号	组分名称	产品编号/规格
		11148ES10(10 T)	11148ES50(50 T)
11148-A	Hifair® miRNA RT enzyme mix	17.5 μL	87.5 μL
11148-B	2×Hifair® miRNA RT buffer	50 μL	250 μL
11148-C	RNase-free H2O	2 mL	10 mL
11148-D	Universal Reverse Primer (10 μM)	800 μL	4 mL
11148-E	U6 Forward Primer (10 μM)	100 μL	500 μL
11148-F	U6 Reverse Primer (10 μM)	100 μL	500 μL

 

运输与保存方式

冰袋运输。-20℃保存，有效期1年。

 

操作步骤

一、体系配制

室温融化Hifair^® miRNA RT enzyme mix和2×Hifair^® miRNA RT buffer后轻微颠倒混匀，置于冰上并按下表配置反应体系：

组分	体积 (μL)	终浓度
2×Hifair® miRNA RT buffer	5	1×
Hifair® miRNA RT enzyme mix	1.75	-
RNA*	-	X
RNase-free H2O	Up to 10	-

*总RNA及提取的miRNA的浓度范围10 pg-2 μg，合成的miRNA拷贝数最低可达60 copies，投入体积不超过3.25 μL。

 

二、逆转录程序

移液器轻轻混匀上述配制的反应液，按下表程序进行miRNA的逆转录反应：

反应温度	反应时间	备注
37℃	50 min	miRNA加A尾及反转录过程
85℃	5 sec	酶失活过程

【注】：逆转录产物可直接进行下游qPCR检测。为避免逆转录体系对qPCR反应的抑制，可将产物稀释10-1000倍后使用。若短时间内不进行下游实验，可放置于-20℃保存。若长期保存，建议分装后，于-80°C保存，避免反复冻融。

 

注意事项

1）使用前，将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用。

2）实验时，请使用无RNase污染的耗材，避免不必要的损失影响实验结果。

3）本产品避免反复冻融，配制时应避免强光照射。

4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5）本产品仅作科研用途！

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