一、显微注射的挑战与RNP策略优势

基因编辑动物模型（如基因敲除小鼠、基因敲入大鼠、斑马鱼突变体等）是生命科学研究和药物开发中不可或缺的工具。传统的动物模型构建依赖于胚胎干细胞（ES细胞）打靶技术，周期长（通常需要12-18个月）、操作复杂、成本高昂。CRISPR-Cas9技术的出现彻底改变了这一局面——通过直接将基因编辑组分显微注射至受精卵中，可在2-3个月内获得首建者（F0 Founder）动物。

在显微注射策略中，Cas9 RNP形式（即预先组装的Cas9蛋白+sgRNA核糖核蛋白复合物）相比mRNA和质粒DNA具有无可比拟的优势：

(1) 起效快——RNP进入受精卵后立即启动基因编辑，无需等待转录翻译；

(2) 嵌合率低——由于起效窗口短暂，编辑更倾向于发生在单细胞阶段；

(3) 脱靶风险小——RNP在胚胎内半衰期短，减少持续编辑导致的脱靶事件。

二、文献案例精读

斑马鱼基因敲除——STAR Protocols标准方案^[2]

STAR Protocols (2022)发表的斑马鱼CRISPR-Cas9基因敲除方案提供了从sgRNA设计到F1纯合子筛选的完整实验流程。该方案中，RNP组装采用Cas9 250 ng/μL + sgRNA 500 ng/μL的终浓度，37°C孵育15分钟，一次性注射80-100枚胚胎。通过异源双链迁移分析（HMA）快速初步筛选F0嵌合体，再通过杂交获得可遗传的突变等位基因。研究以PHLPP1基因为例，展示了从注射到获得纯合子约需10-12个月的完整时间线。

三、详细操作Protocol

3.1 小鼠胚胎显微注射

适用场景：小鼠基因敲除（KO）、基因敲入（KI）、点突变引入。

3.1.1 RNP组装

① crRNA:tracrRNA退火（总体积10 μL）：

PCR仪程序：95°C 5分钟 → 以-5°C/min速率降温至25°C。完成后冰上保存。

【重要提示】如果使用的是sgRNA，则直接用显微注射缓冲液稀释至所需浓度即可。

② RNP-PNI混合液配制（10 μL单次分装量）：

【重要提示】Cas9:sgRNA摩尔比约为1:3（0.2 μM Cas9 : 0.6 μM sgRNA），确保sgRNA过量以充分结合Cas9。

③ 室温孵育15分钟 → 加入ssDNA供体模板混匀 → 离心过滤（0.22 μm滤膜，12,000×g，2分钟） → 分装10 μL/管 → -80°C保存。

3.1.2 显微注射操作

① 注射当天：取一管RNP分装液，冰上解冻。20,000×g、4°C离心5分钟。取9.5 μL上清转移至新管，冰上放置待用。

② 装载注射针：用微量上样枪头（Microloader tip）从针尾端将RNP混合液装入注射针，避免引入气泡。

③ 原核注射：注射参数参考——注射压力200-400 hPa，注射时间0.1-0.2秒，补偿压力10-20 hPa。每枚受精卵注射约1-2 pL（以原核轻微膨胀为判断标准）。

④ 注射后胚胎培养：将注射后的受精卵在KSOM培养基中、37°C、5% CO₂条件下培养至2-细胞期，筛选存活胚胎进行输卵管移植。

【重要提示】如果注射过程中出现针头堵塞，不要反复尝试用同一根针强行注射——这会导致胚胎损伤。应立即更换新针，并从新的RNP分装管中重新装载。

3.2 斑马鱼胚胎显微注射

适用场景：斑马鱼基因敲除、基因敲入、转基因。

① RNP组装（使用含盐缓冲液）：使用Cas9 RNP显微注射缓冲液（20 mM HEPES-KOH, 150 mM KCl, pH 7.5）将SpCas9蛋白稀释至3 μM，将等体积的3 μM gRNA与3 μM Cas9混合，37°C孵育10 min。

② 配制敲入注射液（含供体）：将lssDNA（供体）溶液与1.5 μM RNP混合，配制终浓度为0.2 μM的lssDNA，和终浓度为1 μM RNP的敲入注射液。

③ 显微注射：将注射液注射至一细胞期胚胎的细胞质，每个胚胎注入1.5 nL（即1.5 fmol RNP + 0.3 fmol lssDNA）。

③ 注射后培养：将胚胎转移至E3培养基中，28°C培养。注射后3小时内多次观察，及时移除死亡胚胎。

3.3 F0首建者基因型鉴定

小鼠：(1) 注射后胚胎移植至假孕母鼠，约19-21天后幼崽出生；(2) 幼崽2周龄时剪尾提取基因组DNA；(3) PCR扩增靶位点区域+Sanger测序；(4) TIDE分析或直接观察测序峰图判定基因型；(5) F0阳性小鼠与野生型小鼠交配，筛选可遗传的F1突变体。

斑马鱼：(1) 注射后24小时取8枚胚胎+1枚未注射对照，分别提取基因组DNA；(2) HMA（异源双链迁移分析）初步评估编辑效率；(3) F0嵌合体饲养至性成熟（约3个月），与野生型杂交；(4) F1胚胎基因型鉴定筛选杂合子；(5) F1杂合子自交获得F2纯合子。

四、翌圣基因编辑相关产品推荐

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产品应用	产品定位	产品名称	产品货号
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低脱靶基因编辑	高保真Cas9	HiFi Cas9 Nuclease (5 mg/mL)	14704ES
单链切口编辑	切刻型Cas9（D10A）	Cas9 D10A Nickase (5 mg/mL)	14706ES
荧光示踪/流式分选富集	带EGFP标签的野生型SpCas9	NLS-Cas9-EGFP Nuclease (10 mg/mL)	14707ES
转录调控/染色质免疫沉淀	无剪切酶活性的Cas9	dCas9 Nuclease (10 mg/mL)	14705ES
AI设计高保真基因编辑	AI设计高保真Cas9类似物	OpenCRISPR-1 (10 mg/mL)	14703ES
恒温扩增/核酸检测	野生型Cas12a	ArCas12a Nuclease (10 μM)	14702ES
	野生型Cas12b	AapCas12b Nuclease (10 μM)	14808ES
Cas9 sgRNA体外合成	Cas9 sgRNA合成试剂盒	Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit	11355ES
基因编辑效率检测	基因编辑效率检测	T7 Endonuclease I (10 U/µL)	14548ES

五、常见问题与解决方案（FAQ）

Q1：严格按照过滤步骤操作后仍然堵孔或出现沉淀？

A1：① 翌圣Cas9蛋白储液配方为10 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 50% Glycerol, pH 7.4，使用无盐的缓冲液或TE缓冲液可能会导致Cas9蛋白沉淀，推荐使用显微注射缓冲液（20 mM HEPES-KOH, 150 mM KCl, pH 7.5）。

② RNP组装后离心过滤（去除残余颗粒）：RNP复合物组装完成后，使用0.22 μm离心过滤器，12,000×g离心2分钟。此步骤可去除即使在高盐条件下也可能存在的微量蛋白聚集体和不可溶颗粒。

③ 使用前超速离心：显微注射当天，将RNP分装管从-80°C取出后冰上解冻，20,000×g、4°C离心5分钟。小心吸取90%上清液至新的无核酸酶管中，弃去管底可能的微量沉淀。

④ 分装策略：将RNP显微注射混合液分装为单次使用量（10 μL/管），-80°C保存。每次注射只取一管，避免反复冻融。Tip：一次注射可用同一根针注射>100枚胚胎，但建议多备几管以应对针头意外断裂。

  

Q2：显微注射后胚胎存活率低（<50%）？

A2：(1) RNP浓度是否过高——尝试降低50%浓度，斑马鱼Cas9耐受上限约800 ng/μL，小鼠约350 ng/μL；(2) 注射体积是否过大——小鼠原核注射控制在1-2 pL，斑马鱼控制在1-2 nL；(3) KCl浓度是否过高——300 mM KCl方案已被Burger等（2016）验证斑马鱼胚胎耐受良好，但对于小鼠等哺乳动物胚胎，建议从150 mM KCl起始；(4) 针尖是否过粗——过粗的针尖对胚胎造成过大物理损伤；(5) 胚胎质量——使用新鲜收集的优质受精卵。

  

Q3：F0小鼠的基因编辑效率很低（<10%）？

A3：建议：(1) 使用多条sgRNA（2-3条）混合注射，增加靶位点覆盖率；(2) 提高RNP浓度但注意毒性平衡；(3) 尝试在2-细胞期进行第二轮补充注射（二次注射策略）；(4) 确保sgRNA设计在物种特异性基因组上验证过。

  

Q4：冷冻保存的RNP与新鲜组装的RNP编辑效率有差异吗？

A4：略有下降（约5-15%），但在可接受范围内。建议每管分装为单次用量，避免反复冻融。显微注射当天超速离心取上清是维持效率的关键步骤。

  

Q5：为什么显微注射RNP和电转RNP时的用量差异非常大？

A5：① 递送效率的天壤之别：显微注射是物理性地“强迫”RNP进入细胞，递送效率接近100%。而电转是让细胞在电场作用下“被动”吸收，实际进入每个细胞的RNP数量不仅少，而且个体差异大。为了弥补这种低效和不确定性，只有提升总量，才能保证最终的有效编辑效率。

② 细胞数量级的巨大差异：胚胎显微注射是逐个处理的，而哺乳动物细胞的电转，一次反应就要处理1×10⁶个细胞。可想而知，要让这百万个细胞都接触到足够多的RNP，需要的绝对量自然非常庞大。

六、参考文献

[1] Takara Bio. Mouse genome engineering made simple: ex vivo RNP-ssDNA microinjection protocol for precise editing. 2024.

[2] CRISPR-Cas9-induced gene knockout in zebrafish. STAR Protocols, 2022, 3(4): 101779.

[3] PNA Bio. Embryo injection for CRISPR/Cas9 RNP complex. Technical Protocol, 2024.

[4] Wefers B, et al. Generation of targeted mouse mutants by embryo microinjection of CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins. Methods in Molecular Biology, 2017.

[5] Biase FH, Schettini G. Protocol for the electroporation of CRISPR-Cas for DNA and RNA targeting in Bos taurus zygotes. STAR Protocols, 2024, 5(1): 102940.

[6] Burger A, Lindsay H, Felker A, et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development, 2016, 143(11): 2025-2037. DOI: 10.1242/dev.134809.

[7] Anders C, Niewoehner O, Duerst A, Jinek M. Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature, 2014, 513: 569-573.

[8] Efficient CRISPR-Cas9-Mediated Knock-In of Composite Tags in Zebrafish Using Long ssDNA as a Donor. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 2020, 8: 598634.