一、为什么选择Cas9 RNP进行细胞基因敲除？

CRISPR-Cas9技术已成为生命科学研究中不可或缺的基因编辑工具。在哺乳动物细胞中实现基因敲除（Gene Knockout, KO），传统方法依赖于质粒DNA（pDNA）或mRNA的递送，但这些方式存在脱靶风险高、编辑窗口不可控、需要经过细胞内转录翻译等复杂过程的问题。相较之下，直接递送Cas9蛋白与向导RNA（gRNA）预先组装形成的核糖核蛋白复合物（Ribonucleoprotein, RNP），能够绕过转录和翻译步骤，实现"即递即编"，具有起效快、脱靶率低、无外源DNA整合风险等显著优势。

Bamundo等人^[1]在2024年发表于《Current Protocols》的研究中，详细报道了利用电转（Nucleofection）技术将Cas9 RNP递送至原代人角质形成细胞（Primary Human Keratinocytes）中，成功实现了高效基因敲除、基因组片段删除以及同源定向修复（HDR）介导的定点突变。该研究为Cas9 RNP在难转染原代细胞中的应用提供了系统化的操作方法。

本文将以这一文献案例为基础，结合我们在HEK293T、HeLa等常用细胞系中的实践经验，为您呈现一套经过优化的Cas9 RNP电转基因敲除标准方案。

二、文献案例精读

2.1 研究亮点

该研究针对原代人角质形成细胞（HKs）这一出了名难转染的细胞类型，建立了三套完整的Cas9 RNP基因编辑方案：

(1) 通过Indel突变实现基因敲除；

(2) 使用双sgRNA实现特定基因组区域删除；

(3) 利用HDR系统引入定点突变，在未进行单克隆筛选的情况下，即可获得高效的基因编辑群体。

2.2 关键发现

① Cas9 RNP核转染在原代角质形成细胞中的编辑效率可达70-90%，远超传统脂质体转染方法；

② RNP复合物的Cas9与sgRNA摩尔比是影响编辑效率的关键因素，推荐1:1.2至1:2（Cas9:sgRNA）；

③ 电转程序的选择对细胞存活率和编辑效率有显著影响，需针对不同细胞类型进行优化；

④ 该方法同样适用于N/TERT2G永生化角质形成细胞及其他上皮来源的肿瘤细胞系。

三、详细操作Protocol

3.1 sgRNA设计与合成

① 选择靶基因和靶向区域。建议靶向基因编码区的早期外显子（通常为第2-4外显子），且位于起始密码子ATG下游，以确保提前终止密码子（PTC）介导的无义介导衰变（NMD）。

② 使用在线工具设计sgRNA。推荐工具：

n CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/)；

n 张锋实验的CRISPOR（https://crispor.gi.ucsc.edu/）

选择On-target score高、Off-target score低的sgRNA序列，每个基因建议设计3-4条候选sgRNA。

③ 合成sgRNA：推荐使用化学合成的单链sgRNA，或使用翌圣Hifair^® Precision sgRNA Synthesis Kit （Cat#11355ES）合成所需的sgRNA。

3.2 Cas9 RNP复合物组装

① sgRNA稀释：用无核酸酶水或1×TE Buffer（pH 7.5）将sgRNA干粉溶解并稀释至100 μM储备液，分装后-80°C保存。

② Cas9蛋白准备：翌圣Cas9核酸酶（Cat# 14701ES）通常以10 mg/mL（约61 μM）的浓度提供，使用前短暂离心，冰上操作。

③ RNP组装：按下表配制RNP复合物（单次电转用量）：

④ 孵育：轻轻吹打混匀（勿涡旋），室温（20-25°C）孵育20分钟，使Cas9蛋白与sgRNA充分结合形成RNP复合物。孵育结束后置于冰上待用。

⚠ 关键参数：Cas9与sgRNA的摩尔比建议为1:1至1:3，过量的sgRNA有助于确保所有Cas9蛋白充分结合，提高切割效率。

3.3 细胞准备

①细胞培养：在电转前48小时对细胞进行传代，确保电转当天细胞处于对数生长期，汇合度达到70-90%。

②细胞消化：吸去培养基，用PBS润洗细胞1次。加入TrypLE Express，37°C孵育2-3分钟至细胞变圆，避免过度消化。

③终止消化：加入等体积的完全培养基终止消化，轻轻吹打使细胞分散为单细胞悬液。

④离心收集。将细胞悬液转移至离心管中，800×g离心5分钟，弃上清。

⑤ PBS洗涤。用10 mL PBS重悬细胞沉淀，800×g离心5分钟，弃上清。

⑥计数。用适量PBS重悬细胞，取10 μL与10 μL台盼蓝混合后进行细胞计数和活力评估。细胞活力应≥90%。

⑦调整细胞数量。根据计数结果，取所需细胞量（每次电转建议1×10⁵至5×10⁵个细胞），800×g离心5分钟，弃上清待用。

⚠ 注意：根据不同细胞类型调整细胞数量。HEK293T细胞推荐每次电转1.5×10⁵个；HeLa细胞推荐2×10⁵个；原代细胞通常需要更多，约5×10⁵至1×10⁶个。

3.4 电转操作

①配制电转液：根据电转次数，按每次16.4 μL Nucleofector™ Solution + 3.6 μL Supplement的比例配制电转液（总量=20 μL/次×电转次数+10%余量）。

②重悬细胞：用电转液重悬步骤3.4中准备好的细胞沉淀，轻轻吹打混匀。

③混合RNP与细胞：按下表配制细胞-RNP电转混合物：

④转移至电转杯：将25 μL混合物小心加入电转杯（Nucleocuvette™ Strip）底部，避免产生气泡。

⑤电转：将电转杯放入Lonza 4D-Nucleofector，选择合适的电转程序。

⑥复苏：电转完成后立即向电转杯中加入100 μL预热的完全培养基（37°C），轻轻吹打混匀后将细胞悬液转移至含900 μL预热培养基的24孔板中。

⑦培养：将细胞培养板放入37°C、5% CO₂培养箱中培养。电转后4-6小时可更换新鲜培养基以去除死细胞碎片。

3.5 基因编辑效率检测（TIDE分析）

①收集细胞：电转后48-72小时，消化收集细胞。取约2×10⁵个细胞用于基因组DNA提取。

②基因组DNA提取：使用翌圣MolPure^® Cell/Tissue DNA Kit（Cat#18700ES）进行基因组DNA提取，所得提取产物可直接作为PCR模板。

③PCR扩增靶位点区域。设计扩增靶位点上下游各约300-600 bp的PCR引物，使用2× Hieff Canace^® Plus PCR Master Mix (With Dye)（Cat#10154ES）进行PCR扩增。反应体系：2× PCR Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μM）各1 μL，基因组DNA模板2 μL，补水至25 μL。

④PCR产物纯化与Sanger测序。取5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳确认条带特异性，送Sanger测序（测序引物为PCR上游或下游引物）。

⑤TIDE分析。将Sanger测序.ab1文件上传至TIDE在线分析工具（https://tide.nki.nl/），输入sgRNA靶序列（PAM前20 bp），点击"Update View"获取编辑效率（% Indels）和各类突变类型的分布。

⚠ 补充方法：除TIDE外，还可使用ICE分析（https://ice.synthego.com/）、T7E1酶切法或Surveyor assay进行编辑效率验证。对于有条件的实验室，推荐进行NGS深度测序以获得更精确的编辑效率。

3.6 单克隆筛选与基因型鉴定（可选）

如需要获得纯合的基因敲除细胞系，可在电转后进行以下操作：

① 电转后48小时，消化细胞并进行有限稀释至96孔板（0.5-1个细胞/孔）；

② 培养2-3周，标记单克隆孔；

③ 胰酶消化传代至96孔板和24孔板，96孔板用于基因组DNA提取和PCR鉴定，24孔板用于维持培养；

④ PCR扩增靶位点 + Sanger测序确定基因型，筛选双等位基因敲除（biallelic KO）克隆；

⑤ Western Blot验证蛋白水平敲除效果。

3.7 电转条件优化指南

如果使用推荐的电转程序编辑效率不理想，可按以下策略进行优化：

① RNP用量梯度：固定电转程序，测试不同RNP用量（如1×、2×、3×），观察编辑效率和细胞毒性之间的平衡。

②Cas9:sgRNA摩尔比：测试1:1、1:1.5、1:2、1:3等不同比例，通常1:1.5~1:2可获得最佳效果。

③电转程序筛选：使用Lonza 4D的96孔穿梭系统，可一次性筛选多达96种电转条件。

④细胞状态优化：确保细胞处于对数生长期，汇合度不超过90%，传代次数不宜过多。

⑤电转后培养：电转后4-24小时内避免抗生素处理，使用预热的完全培养基，减少操作扰动。

四、翌圣基因编辑相关产品推荐

翌圣生物拥有基因编辑系统相关的多种高质量产品，可提供高品质Cas蛋白等相关产品。

产品应用	产品定位	产品名称	产品货号
基础基因编辑	野生型SpCas9	Cas9 Nuclease (10 mg/mL)	14701ES
低脱靶基因编辑	高保真Cas9	HiFi Cas9 Nuclease (5 mg/mL)	14704ES
单链切口编辑	切刻型Cas9（D10A）	Cas9 D10A Nickase (5 mg/mL)	14706ES
荧光示踪/流式分选富集	带EGFP标签的野生型SpCas9	NLS-Cas9-EGFP Nuclease (10 mg/mL)	14707ES
转录调控/染色质免疫沉淀	无剪切酶活性的Cas9	dCas9 Nuclease (10 mg/mL)	14705ES
AI设计高保真基因编辑	AI设计高保真Cas9类似物	OpenCRISPR-1 (10 mg/mL)	14703ES
恒温扩增/核酸检测	野生型Cas12a	ArCas12a Nuclease (10 μM)	14702ES
	野生型Cas12b	AapCas12b Nuclease (10 μM)	14808ES
Cas9 sgRNA体外合成	Cas9 sgRNA合成试剂盒	Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit	11355ES
基因编辑效率检测	基因编辑效率检测	T7 Endonuclease I (10 U/µL)	14548ES

五、常见问题与解决方案（FAQ）

Q1：Cas9 核酸酶，10mg/mL换算成摩尔浓度是多少？

A1： 

Q2：RNP组装后可以保存多久？

A2：RNP复合物组装后建议立即使用。如需保存，可分装后-80°C冻存，但不超过1周，且避免反复冻融。使用前冰上解冻。

Q3：电转后细胞大量死亡怎么办？

A3：可能的原因：(1) RNP用量过高→降低Cas9蛋白用量；(2) 电转程序过强→尝试较温和的程序；(3) 细胞状态不佳→使用低代次、对数生长期细胞；(4) 电转后未及时加入培养基→电转完成后立即加入预热培养基。

Q4：TIDE分析显示编辑效率低于10%？

A4：按以下顺序系统性排查（从最常见到最罕见）：

(1) sgRNA设计问题（约占40%的失败案例）：重新设计3-4条sgRNA，靶向不同外显子。使用CHOPCHOP或CRISPick评估on-target score。

(2) 转染/电转效率低：用荧光蛋白NLS-Cas9-EGFP Nuclease （Cat#14707ES）作为阳性对照，验证基因递送效率是否>50%。

(3) 细胞类型问题：某些细胞类型天然难以编辑（如原代神经元、B细胞）。

(4) 检测方法问题：TIDE分析对测序峰图质量要求高——如果测序信号弱、背景高，TIDE结果不可靠。尝试用T7E1或ICE交叉验证。

(5) PAM位点多态性：靶序列在特定细胞系中可能存在SNP，导致sgRNA无法有效配对。PCR扩增靶位点后先测序确认序列与参考基因组一致。

Q5：如何提高双等位基因敲除的概率？

A5：使用2-3条靶向同一基因不同位点的sgRNA混合电转，可提高KO效率；电转后72-96小时再进行单克隆分选（给细胞更多编辑时间）；筛选时进行多轮测序确认。

Q6：可以用PBS代替电转专用缓冲液吗？

A6：不推荐。电转缓冲液的离子成分和渗透压经过优化，对细胞存活和转染效率至关重要。使用PBS等替代缓冲液会显著降低电转效率并增加细胞死亡。

Q7：使用14701ES时候，如何设计sgRNA？

A7：本产品来源于野生型酿脓链球菌S.pyogenes。单导向RNA（sgRNA）骨架可使用

5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG -3’

"N"代表与DNA靶标序列特异性结合的20个核苷酸序列。

推荐购买翌圣货号11355ES的sgRNA合成试剂盒Hifair^® Precision sgRNA Synthesis Kit。只需根据目标区域设计，纯化后的sgRNA产物可搭配Cas9使用。

六、参考文献

[1] Bamundo M, Palumbo S, D'Auria L, et al. CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Nucleofection for Genome Editing in Primary Human Keratinocytes: Knockouts, Deletions, and Homology-Directed Repair Mutagenesis. Current Protocols, 2024, 4(8): e70056.

[2] Lin Y, Wagner E, Lächelt U. Non-viral delivery of the CRISPR/Cas system: DNA versus RNA versus RNP. Biomaterials Science, 2022, 10: 1166-1192.

[3] Taha EA, Lee J, Hotta A. Delivery of CRISPR-Cas tools for in vivo genome editing therapy: Trends and challenges. Journal of Controlled Release, 2022, 342: 345-361.

[4] Brinkman EK, et al. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research, 2014, 42(22): e168.

[5] Seki A, Rutz S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine, 2018, 215(3): 985-997.