一、引言：从随机敲除到精准敲入

基因敲除（KO）只能实现基因功能的"减法"，而在许多研究场景中，我们需要的恰恰是"加法"或"修改"——例如在目的基因C端敲入荧光蛋白标签（GFP/mCherry/Flag/HA）、引入疾病相关点突变、插入报告基因（如luciferase）、或构建条件性敲除等位基因（floxed allele）。这就需要借助同源定向修复（Homology-Directed Repair, HDR）通路，利用外源供体DNA模板实现精准的基因组编辑。

HDR供体模板主要分为两大类：单链DNA（ssDNA/ssODN）供体和双链DNA（dsDNA）供体。ssDNA供体以其低细胞毒性和低随机整合率受到广泛关注，尤其适合点突变和短标签敲入。然而，dsDNA供体（包括PCR线性片段和质粒载体）凭借制备简便、成本低廉、可携带大片段插入（>3 kb）等优势，仍然是绝大多数实验室最常用的HDR供体形式。

本文结合2023-2024年发表的多篇高质量文献，为您同时呈现ssDNA和dsDNA两种供体的完整Cas9 RNP HDR基因敲入方案，并附详细的供体类型对比与选择指南。

二、文献案例精读

2.1 案例一（ssDNA/ssODN）：人原代T细胞高效HDR敲入^[1]

该研究详细描述了在人原代T细胞中利用Cas9 RNP和ssDNA供体HDR系统实现基因敲入的完整流程。研究者成功将P2A-荧光报告基因和目的基因过表达盒靶向敲入LCK基因位点。

关键参数：

(1) 同源臂长度为500-1000 bp；

(2) ssDNA供体模板浓度为10-25 ng/μL；

(3) 采用Lonza 4D电转仪和EH-115程序；

(4) 电转后加入HDR增强剂（如NU7441 DNA-PK抑制剂或RS-1 Rad51激活剂）可提升HDR效率2-3倍。

该方案同样适用于T细胞功能基因的敲入和报告基因标记。

2.2 案例二（ssODN点突变）：原代角质形成细胞定点突变^[2]

该研究报道了利用RNP核转染+HDR在原代和永生化人角质形成细胞中引入定点突变的成熟方案。

其核心优化包括：

(1) 使用化学修饰的sgRNA以减少RNP在细胞内的降解；

(2) 供体ssODN（单链寡核苷酸）长度80-120 nt；

(3) 通过限制性酶切（RFLP）+ Sanger测序快速筛选单克隆；

(4) 该方法也适用于N/TERT2G永生化角质形成细胞及其他上皮来源的肿瘤细胞系。

2.3 案例四（dsDNA PCR供体）：GFP11标签敲入内源蛋白标记^[6]

该研究使用Cas9 RNP核转染结合dsDNA供体模板（PCR产物），在HEK293细胞中通过HDR将split-GFP的GFP11标签（约50 bp）敲入内源基因位点。

操作关键点：

(1) 供体用量——1500 pmol HDR模板与500 pmol Cas9、650 pmol sgRNA共电转（供体摩尔数约为Cas9的3倍）；

(2) 电转后2-4天细胞恢复，通过流式检测GFP信号评估KI效率。

2.4 案例四（ssDNA体系）：SERCA2磷酸化位点精准点突变^[7]

该研究利用Cas9 RNP和ssODN供体在HEK293T细胞中将SERCA2蛋白的Ser663位点突变为Ala（S663A），成功建立了疾病相关点突变细胞模型。

HDR策略亮点：

(1) ssODN供体设计在切口处引入一个SacII限制性酶切位点（沉默突变），便于后续使用RFLP快速筛选阳性克隆；

(2) 使用抗性标记质粒（pcDNA4-Zeocin）共转染进行瞬时筛选富集——转染细胞经Zeocin筛选2周后，HDR阳性率可从不足1%提升至10-20%；

(3) 添加Scr7（DNA连接酶IV抑制剂，1 μM）抑制NHEJ通路，促进HDR发生。

2.5 供体类型选择

按以下优先级选择供体类型：

（1）点突变或短标签（<50 bp）→ 优先选择ssODN（化学合成，120-180 nt总长度），细胞毒性最低，随机整合概率低。

（2）中等片段KI（50-1000 bp，如荧光蛋白标签）→ ssDNA（链酶法制备）或线性dsDNA（PCR产物）均可。若细胞对dsDNA毒性敏感（如原代细胞），优先选ssDNA；若追求操作便捷和成本低，优先选dsDNA。

（3）大片段KI（1-5 kb，如条件性敲除盒）→ 线性dsDNA（PCR产物）是首选。长片段ssDNA制备效率低，而dsDNA PCR产物可轻松扩增至5 kb，同源臂长度（400-800 bp）灵活可调。

（4）超大片段KI（>5 kb，如完整表达盒）→ 质粒供体（配合AAV递送效果更佳），或考虑双sgRNA策略切出大片段+HDR供体填补。

（5）原代细胞/免疫细胞等敏感细胞 → ssDNA/ssODN优先。虽然dsDNA效率更高，但敏感细胞可能无法耐受dsDNA引起的固有免疫应答（cGAS-STING通路激活）。

三、详细操作Protocol

Part A——ssDNA/ssODN供体方案（推荐用于点突变和短标签KI）

1、ssDNA/ssODN供体模板设计与制备

①（长片段ssDNA供体，500-3000 bp插入）：步骤：(1) PCR扩增双链DNA供体（含同源臂+插入序列+同源臂）；(2) 将其中一个PCR引物5'端磷酸化；(3) 使用Lambda Exonuclease（Cat14527ES）特异性消化磷酸化链，保留非磷酸化单链；(4) 柱纯化ssDNA产物，通过凝胶电泳和Sanger测序确认完整性。

②（短ssODN供体，<200 nt，点突变或短标签）：直接化学合成ssODN，总长度约120-180 nt；(2) 中心为突变/插入序列；(3) 两侧各≥60 nt的同源臂；(4) 需在PAM或sgRNA靶序列中引入沉默突变（同义突变），防止Cas9切割已正确整合的等位基因 ；(5) 如后续需筛选，可在切口处额外引入一个限制性内切酶位点用于RFLP筛选 。

2、ssDNA供体HDR电转操作流程

以HEK293T细胞GFP标签C端敲入为例：

步骤1：sgRNA设计。靶向目的基因终止密码子附近区域，PAM位点尽量靠近终止密码子（理想距离<10 bp）。使用CHOPCHOP或CRISPick设计2-3条候选sgRNA，通过T7E1或TIDE预实验筛选切割效率最高的一条（>70%）。

步骤2：ssDNA供体设计。5'同源臂（约500 bp）- GFP编码序列（不含启动子）- 3'同源臂（约500 bp）。在GFP编码序列中使用人源密码子优化，并在sgRNA靶位点引入同义突变。

步骤3：Cas9 RNP组装（单次电转用量）：

室温（20-25°C）孵育15-20分钟。

步骤4：电转混合物配制（25 μL总体积）：

步骤5：电转（Lonza 4D, CM-130程序）。电转后立即加入100 μL预热培养基，转移至24孔板。详细操作同"Cas9 RNP电转哺乳动物细胞基因敲除标准方案（加超链接）"。

步骤6（可选推荐）：HDR增强。电转后4-6小时，在培养基中加入NU7441（DNA-PK抑制剂，终浓度1-5 μM）或RS-1（Rad51激活剂，终浓度7.5-15 μM），处理24-48小时后更换正常培养基。

Part B——dsDNA供体方案（推荐用于中-大片段KI和常规实验室操作）

1、dsDNA供体模板设计与制备

方案B-1——PCR线性dsDNA供体：

（1）供体片段设计：5'同源臂（400-800 bp） + 插入序列（50-5000 bp）+ 3'同源臂（400-800 bp）。对于>1 kb的插入片段，同源臂推荐800 bp以确保充足的HDR配对区域。

（2）PCR扩增：使用高保真DNA聚合酶（如Hieff Canace®Veritas Long PCR Master Mix (No Dye)（Cat#10165ES）），以质粒或基因组DNA为模板扩增供体片段。PCR引物需跨越同源臂-插入序列的连接区，确保扩增产物为完整的供体模板。

（3）PCR产物纯化：使用琼脂糖凝胶回收试剂盒或PCR纯化柱进行纯化。此步骤至关重要——残留的引物二聚体、非特异性扩增产物和PCR buffer中的离子成分可能干扰电转效率并增加细胞毒性。

（4）质量控制：(a) 琼脂糖凝胶电泳确认单一预期条带；(b) NanoDrop或Qubit精确定量（A260/A280比值1.8-2.0为佳）；(c) Sanger测序确认供体序列无误，特别是同源臂与插入序列的连接处和sgRNA靶位点的沉默突变。

（5）在供体序列靠近DSB切割位点处引入一个独特的限制性酶切位点（沉默突变），用于后续RFLP快速筛选阳性克隆。

方案B-2——质粒dsDNA供体：

（1）将供体片段（同源臂+插入+同源臂）克隆至pUC19或pBluescript等高拷贝载体中，避免使用含哺乳动物复制起点（如oriP/SV40 ori）或哺乳动物启动子的载体——这些元件可能增加随机整合和表达风险。

（2）大量制备质粒DNA，强烈推荐使用无内毒素（EndoFree）质粒提取试剂盒MolPure^® Endo-free Plasmid Mini Kit (Cat#19021ES)。内毒素污染是导致质粒供体细胞毒性的首要原因。该发现已被多项独立研究证实。

（3）质粒供体可以在HDR后提供抗生素筛选标记（如嘌呤霉素、Zeocin），选择性富集HDR阳性细胞——这是质粒供体相对于线性dsDNA的显著优势。如需瞬时筛选，可在供体质粒骨架中放置抗性基因表达盒，电转后24-48小时施加筛选压力维持1-2周。

2、dsDNA供体HDR电转操作流程

以下操作以PCR线性dsDNA供体为例（质粒供体操作类似）：

（1）sgRNA设计与预验证。同Part A方案，确保sgRNA切割效率≥70%。

（2）Cas9 RNP组装（同Part A方案，可适当提高Cas9用量至150 pmol以适应dsDNA供体的竞争效应）：

室温孵育15-20分钟。

（3）dsDNA供体-RNP-电转混合物配制（25 μL总体积）：

【dsDNA用量优化建议】dsDNA供体是一把双刃剑——用量过低导致HDR效率不足，用量过高导致细胞毒性。建议初次尝试时设置梯度：200 ng、400 ng、800 ng、1200 ng/次电转，找到效率和存活率的最佳平衡点。对于大多数贴壁细胞（HEK293T、HeLa等），400-800 ng是常用的起始范围。

（4）电转。Lonza 4D, CM-130程序（HEK293T）或对应细胞类型的推荐程序。电转后操作同Part A方案。

（5）（可选）：细胞周期同步化增强HDR。在电转液中直接添加nocodazole（终浓度100-200 ng/mL），或将细胞在电转前用nocodazole预处理16-18小时使其同步至G2/M期。电转后6小时更换为不含nocodazole的培养基。此策略已被证实可将HDR效率提升2-4倍。

3、dsDNA供体使用注意事项

（1）随机整合风险：线性dsDNA末端可被细胞内的NHEJ机器识别并随机连接至基因组断裂处。这是dsDNA供体相对于ssDNA的主要劣势。降低策略：①控制供体用量在500 ng以下；②在Junction PCR筛选阳性克隆时，务必同时做5'和3'两端的Junction PCR——如果仅有单端Junction PCR阳性，可能是随机整合或截断整合；③在供体片段的5'和3'末端设计一段独特的引物序列（不匹配基因组任何位点），用于后续基因组PCR排除随机整合。

（2）纯度和内毒素：dsDNA供体（尤其是PCR产物和质粒）的纯度对HDR效率和细胞存活率影响极大。具体要求：① A260/A280比值1.8-2.0；② 琼脂糖凝胶电泳单一条带，无smear；③ 质粒供体必须用EndoFree试剂盒去除内毒素；④ 推荐使用Qubit荧光定量替代NanoDrop，因为RNA和ssDNA残留会干扰A260读值。

四、HDR编辑效率评估与单克隆筛选（ssDNA/dsDNA通用）

4.1 编辑效率评估方法

① RFLP分析：如果在供体序列中引入了独特的限制性酶切位点，对靶位点PCR产物进行酶切分析。切割条带强度占总条带强度的比例≈HDR效率。这是最简便的初筛方法。

② 数字PCR（ddPCR）：设计一对引物跨越5'同源臂与插入序列的连接处（5' Junction），通过ddPCR绝对定量HDR事件数。同时设计一对扩增靶位点所有等位基因（无论是否编辑）的引物作为内参。HDR效率 = Junction拷贝数 / 总靶位点拷贝数 × 100%。ddPCR是目前最精确的HDR定量方法。

③ 流式细胞术：如果敲入的是荧光蛋白（GFP/mCherry等），电转后5-7天直接通过流式检测荧光阳性细胞比例。

④ NGS深度测序：对靶位点扩增子进行NGS测序，可同时定量HDR、NHEJ Indel和野生型等位基因，获得完整编辑图谱。在大规模筛选场景下推荐使用。

4.2 单克隆HDR阳性细胞系筛选流程

① 电转后48小时，流式分选荧光阳性细胞（如有荧光标记），或直接进行有限稀释铺板。如果使用了Zeocin/嘌呤霉素等筛选标记，可在电转后24小时施加筛选压力维持1-2周，以富集转染阳性细胞。

② 培养2-3周，96孔板单克隆形成后标记并传代。一板传代至96孔板（用于gDNA提取），另一板传代至24孔板（用于维持培养）。

③ Junction PCR初步筛选：使用5' Junction引物对（5'-外侧基因组引物 + 3'-供体内部引物）和3' Junction引物对（5'-供体内部引物 + 3'-外侧基因组引物）分别进行PCR。双Junction PCR同时阳性 → 支持完整HDR整合；仅单端阳性 → 可能存在截断整合或随机整合，需要测序进一步确认。

④ Sanger测序确认：对Junction PCR阳性克隆的靶位点扩增产物进行测序，验证：(a) 插入序列完整无突变；(b) 5'和3' Junction序列正确；(c) sgRNA靶位点已被同义突变保护免于重切割。

⑤ 脱靶分析：使用在线工具（如CRISPOR、Cas-OFFinder）预测Top 5-10个潜在脱靶位点，进行PCR扩增+Sanger测序。

⑥ Western Blot/功能验证：确认蛋白表达和功能（如标签蛋白的免疫荧光定位、酶活性检测等）。

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六、常见问题与解决方案（FAQ）

Q1：HDR效率始终很低（ssDNA和dsDNA均无效）？

A1：可系统排查 [1,6,7]：(1) sgRNA切割效率→TIDE分析应在70%以上，否则需要重新设计sgRNA；(2) 供体模板质量→ssDNA电泳应为单一条带；dsDNA A260/A280应为1.8-2.0；(3) 供体浓度→尝试梯度（ssDNA: 10/25/50/100 ng/μL；dsDNA: 200/400/800/1200 ng）；(4) 同源臂长度→ssODN至少60 nt/侧；dsDNA至少400 bp/侧；(5) 加入HDR增强剂NU7441+RS-1组合；(6) 细胞周期同步化（nocodazole，200 ng/mL，16-18小时）。

 

Q2：dsDNA供体导致大量细胞死亡？

A2：dsDNA的细胞毒性与用量和纯度直接相关 [5,6]：(1) 减少dsDNA用量至200-400 ng/次；(2) 确认供体已充分纯化——使用柱纯化而非乙醇沉淀；(3) 质粒供体必须用EndoFree试剂盒去除内毒素（内毒素是细胞毒性的首要原因 [5]）；(4) 如果使用PCR产物，检查电泳是否有多余条带——非特异性产物可能含有毒性序列；(5) 考虑切换为ssDNA供体——ssDNA的细胞毒性远低于等摩尔量的dsDNA。

 

Q3：dsDNA供体出现严重随机整合？

A3：应对策略 [5,6]：(1) 首选ssDNA供体——ssDNA的随机整合率比dsDNA低10-100倍 [4]；(2) 降低dsDNA用量（<500 ng/次）；(3) 在dsDNA片段末端设计保护性修饰——如在PCR引物5'端添加磷酸基团或生物素标记；(4) 避免使用含哺乳动物复制起点的质粒作为供体；(5) 在单克隆筛选时，务必进行5'和3'双端Junction PCR，排除单端整合的假阳性克隆。

 

Q4：为什么文献中dsDNA效率数据差异如此之大？

A4：文献差异的核心原因 [5,6,8]：(1) 供体纯度——未纯化的PCR产物（含引物二聚体和dNTPs）效率远低于柱纯化产物；(2) 细胞类型——不同细胞的内源性NHEJ/HDR偏好性差异可达10倍以上；(3) 递送方法——电转 vs. 脂质体转染 vs. AAV递送，RNP和供体的进入动力学完全不同；(4) 供体-靶位点距离——切口到KI位点距离从5 bp到50 bp，效率可差5倍 [7]。建议以本实验室预实验的优化结果为准，文献数据仅作参考。

 

Q5：可以同时递送多个供体模板实现多重敲入吗？

A5：理论上可行但在实际操作中效率极低。原因：(1) 每增加一个供体，竞争同一DSB的概率分配降低；(2) 多供体之间的交叉配对可能导致产物嵌合整合；(3) 细胞毒性累加效应。对于多重敲入（如在3个基因位点同时KI），推荐分步进行——先完成一个位点的KI和单克隆筛选，再在同一克隆中进行下一个位点的KI。如果必须同时进行，强烈建议使用ssDNA供体以降低毒性和交叉整合风险。

 

七、参考文献

[1] Generation of gene-of-interest double allele knockout clones in primary human T cells by CRISPR. Cell STAR Protocols, 2023, 4(3): 102411.

[2] Bamundo M, Palumbo S, D'Auria L, et al. CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Nucleofection for Genome Editing in Primary Human Keratinocytes: Knockouts, Deletions, and Homology-Directed Repair Mutagenesis. Current Protocols, 2024, 4(8): e70056.

[3] Howden SE, McColl B, Glaser A, et al. A Cas9 variant for efficient generation of indel-free knockin or gene-corrected human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports, 2016, 7(3): 508-517.

[4] CRISPR/Cas9-mediated targeted knock-in of large constructs using nocodazole and RNase HII. Scientific Reports, 2023, 13: 2628.

[5] Richardson CD, Ray GJ, DeWitt MA, et al. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology, 2016, 34: 339-344.

[6] Tamura R, Kamiyama D. CRISPR-Cas9-Mediated Knock-In Approach to Insert the GFP11 Tag into the Genome of a Human Cell Line. Methods in Molecular Biology, 2023, 2564: 185-201.

[7] Gonnot F, Boulogne L, Brun C, et al. SERCA2 phosphorylation at serine 663 is a key regulator of Ca²⁺ homeostasis in heart diseases. Nature Communications, 2023, 14: 3346.

[8] Chu VT, Weber T, Wefers B, et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nature Biotechnology, 2015, 33: 543-548.