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产品描述
本产品是探针法2×实时定量PCR扩增的预混合溶液。采用的抗体法热启动Unicon® DNA聚合酶（货号：10113ES）可以有效抑制引物非特异性退火导致的扩增。同时，配方优化了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升PCR反应扩增效率的因子，适合低浓度模板的扩增，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的标准曲线。
产品组分
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组分编号 |
组分名称 |
产品编号/规格 |
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11205ES03（1 mL） |
11205ES08（5 mL） |
11205ES25（25 mL） |
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11205-A |
2×Hieff Unicon® qPCR TaqMan Probe Master Mix |
1 mL |
1 mL × 5 |
25 mL |
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11205-B |
50×Low Rox |
40 μL |
200 μL |
1 mL |
|
11205-C |
50×High Rox |
40 μL |
200 μL |
1 mL |
运输与保存方式
冰袋运输。-20℃避光储存，有效期18个月。本品避免反复冻融。建议分装保存。
反应体系
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组分 |
体积（μL） |
体积（μL） |
终浓度 |
|
2×Hieff Unicon® qPCR TaqMan Probe Master Mix |
10 |
25 |
1× |
|
Forward Primer (10 μM) |
0.4 |
1 |
0.2 μM |
|
Reverse Primer (10 μM) |
0.4 |
1 |
0.2 μM |
|
TaqMan Probe (10 μM) |
0.2 |
0.5 |
0.1 μM |
|
50×High or Low Rox |
0.4 |
1 |
1× |
|
模板DNA |
X |
X |
- |
|
无菌超纯水 |
to 20 |
to 50 |
- |
【注】： 使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。
a) 参比染料：Rox的添加，可根据不同仪器型号进行选择，具体可参考【适用机型】。
b) 引物浓度：通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。
c) 探针浓度：探针终浓度在50 nM-250 nM之间。
d) 模板浓度：如模板类型为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。
e) 模板稀释：cDNA原液建议5-10倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的CT值在20-30个循环为好。
f) 反应体系：推荐使用20 μL或50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
g) 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。
扩增程序 （两步法程序）
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循环步骤 |
温度 |
时间 |
循环数 |
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预变性 |
95℃ |
1 min |
1 |
|
变性 |
95℃ |
10 sec |
|
|
退火、延伸 |
60℃ |
30 sec |
40 |
【注】
a) 预变性时间：根据不同模板和引物的具体情况可适当增加预变性时间至3 - 5 min。
b) 退火温度和时间：建议在56-64℃范围内调整。如果反应效果不好，可以适当延长反应时间。
c) 荧光信号采集：请参考仪器设置。
结果分析
定量实验至少需要三个生物学重复。
反应结束后需要确认扩增曲线。进行PCR定量时，需要制作标准曲线。
反应特异性需要琼脂糖凝胶电泳确认。
引物设计指南
1）推荐引物长度25 bp左右。扩增产物长度150 bp为佳，不要低于100 bp，可以在100 bp-300 bp内选择。
2）正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。
3）引物碱基分布要均匀，避免出现连续的4个相同碱基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。
4）引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。
5）引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补。
TaqMan 探针设计指南
1）探针长度一般为18-40 bp。探针序列应尽量接近正向或者反向引物，但不能与之有重合区域。
2）探针的退火温度应为 65-67℃。
3）引物碱基分布要均匀，避免出现连续的4个相同碱基。探针5’端应避免使用碱基G。
4）若序列中包含多态性位点，应使其位于探针序列中间。
适用机型
High Rox适用机型：ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™;
Low Rox 适用机型：ABI 7500, 7500 Fast, ViiA™7, QuantStudio™ 3 and 5, QuantStudio™6,7,12k Flex;
Stratagene MX3000P™, MX3005P™, MX4000P™;
不需要Rox校正的仪器型号：
Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon® 2, Chromo4™;
Eppendorf Mastercycler® ep realplex, realplex 2 s;
Qiagen Corbett Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000;
Roche Applied Science LightCycler® 480, LightCycler® 2.0; Lightcycler® 96;
Thermo Scientific PikoReal Cycler;
Cepheid SmartCycler®; Illumina Eco qPCR.
相关产品
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产品名称 |
货号 |
规格 |
|
11208ES08 |
5 mL |
|
|
11211ES03 |
1 mL |
|
|
Hieff Unicon® Universal TaqMan multiplex qPCR master mix (UDG plus) |
11212ES03 |
1 mL |
|
31301ES60 |
100 µg |
|
|
10303ES60 |
100 U |
|
|
10128ES72 |
250 μL |
HB210604
