背景介绍

随着再生医学、发育生物学及药物研发的快速发展，小鼠胚胎干细胞（mESCs）凭借无限增殖与多向分化潜能，成为连接基础研究与临床应用的核心载体。作为经典模式动物，mESCs 研究起步早、技术体系成熟，近年培养技术的突破，进一步完善了其多能性调控机制，推动其在基因编辑、疾病建模、再生医学等领域的深度应用。

mESCs 源自小鼠早期胚胎内细胞团，可在体外模拟体内发育微环境，既能自我更新，又能分化为三胚层各类细胞，是研究胚胎发育机制、遗传病机理及细胞治疗靶点的理想模型。近年，科研人员围绕全能性捕获、多能性维持、培养体系优化等关键问题展开研究，突破了传统培养局限。

mESCs 培养对环境、试剂及操作要求严苛，核心是通过添加小分子化合物与细胞因子，精准调控信号通路，抑制分化、激活自我更新，从而在体外维持其多能性或全能性。

小鼠胚胎干细胞培养所需的化合物、生化试剂、细胞因子、耗材等：

 

培养方案

一. 小鼠胚胎干细胞的复苏

1、将储存有mESCs的冻存管从液氮中取出，迅速置于37℃水浴中1-2分钟，快速解冻。

2、将冻存管内的mESCs悬液缓慢转移至15 mL无菌锥形离心管中，加入5 mL预温至37℃的mESCs基础培养基，用血清移液管轻轻吹打2-3次，轻柔重悬细胞（避免剧烈吹打损伤细胞，防止多能性丢失，适配小鼠细胞脆弱特性）。

3、设置离心机参数为450 g，离心3分钟，使mESCs充分沉淀，随后缓慢弃去上清液。

4、用1 mL含10 μM Y-27632（Cat# 53006ES）或Y-27632 dihydrochloride（Cat# 52604ES）的基质胶稀释液重悬mESCs，轻轻吹打2-3次至细胞分散均匀，随后加入到预铺基质胶的24孔板中，每孔加入适量重悬液，确保细胞均匀分布（若培养全能性TBLCs，可在此步骤添加10 nM PlaB（Pladienolide B）（Cat# 725961ES）。

5、将24孔板放入37℃、5% CO₂、湿度70%-80%的细胞培养箱内，孵育25-30分钟，使mESCs贴壁。

6、制备mESCs复苏专用培养基。

7、待细胞贴壁后，每孔加入适量复苏专用培养基，覆盖细胞表面即可，避免培养基过多导致细胞缺氧。

8、将培养板放回细胞培养箱，继续培养24小时，期间观察细胞形态，待细胞铺展至50%-60%汇合度，更换新鲜培养基，去除残留冻存液成分。

二. 小鼠胚胎干细胞的培养

1. 复苏后的mESCs培养期间，每2天更换一次新鲜的mESCs完全培养基（含CHIR-99021（Cat# 53003ES）、PD0325901（Cat# 53011ES）、LIF、FBS（40131ES或40132ES）等核心成分；若培养TBLCs，需添加10 nM PlaB），弃去旧培养液时动作轻柔，避免损伤贴壁细胞。

2. 培养过程中每日在显微镜下观察细胞形态，mESCs呈克隆状生长，边缘清晰、细胞排列紧密、形态均一，若出现细胞分化（克隆边缘模糊、细胞形态不规则、多能性标记基因表达下降），及时更换培养基并调整培养条件（可适当提高LIF浓度至20 ng/mL，或添加烟酰胺（Cat# 51402ES）调节表观遗传）。

3. 培养期间可加入适量烟酰胺（Cat# 51402ES），抑制Dnmt3b过度表达，减少mESCs从原始态向始发态的异常转变，维持细胞多能性状态；单独使用LIF培养时，可添加适量DNMTs激活剂，提升细胞适应效率。

4. 持续培养3-4天，待细胞汇合度达到75%-85%时，即可进行传代操作（避免细胞过度汇合导致分化，小鼠细胞汇合度超过90%易出现自发分化。

三. 小鼠胚胎干细胞的传代

1、在显微镜下确认mESCs生长状态良好，无分化、无污染，24孔板每孔细胞汇合度达到75%-85%（全能性TBLCs汇合度控制在70%-80%）。

2、弃去每孔旧培养液，用无菌PBS（Cat# 41403ES）溶液润洗细胞表面1-2次，去除残留培养基及代谢废物，避免影响消化效果。

3、每孔加入适量0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（Cat# 40127ES）消化液，覆盖细胞表面，放入37℃培养箱中孵育2-4分钟，显微镜下观察到细胞变圆、间隙增大时，立即加入含10% FBS（40131ES或40132ES）的培养基终止消化。

4、用血清移液管轻轻吹打细胞，使细胞从培养板底部脱落，形成均匀的细胞悬液，吹打时避免产生气泡，防止细胞破裂。

5、将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中，450 g离心3分钟，弃去上清液，收集细胞沉淀。

6、用mESCs传代培养基重悬细胞，轻轻吹打2-3次，调整细胞密度至适宜浓度（每孔接种400-800个细胞；TBLCs接种密度调整为500-900个细胞）。

7、将重悬后的细胞悬液加入到预铺基质胶的24孔板中，轻轻晃动培养板，使细胞均匀分布，避免细胞聚集导致分化。

8、将培养板放入细胞培养箱，37℃、5% CO₂、湿度70%-80%条件下培养，24小时后观察细胞贴壁及生长情况，更换新鲜传代培养基，去除未贴壁细胞。

9、传代后的mESCs可连续培养1-2周，期间定期更换培养基，根据细胞生长状态调整传代频率（一般3-4天传代一次；TBLCs建议2-3天传代一次，维持全能性状态）。

 

图1.体外培养小鼠多能干细胞系的发育潜能 (A) 着床前胚胎在体内可形成全部胚胎及胚外组织，具备完整发育潜能。(B) 常规胚胎干细胞（ESCs）为多能性，仅参与胚胎组织形成，无法产生滋养层。(C) 经剪接体抑制诱导的全能卵裂球样细胞（TBLCs）具类全能性，可高效形成胚胎及胚外组织（含滋养层）。

 

参考文献

1. Shen H, Yang M, Li S, Zhang J, Peng B, Wang C, Chang Z, Ong J, Du P. Mouse totipotent stem cells captured and maintained through spliceosomal repression. Cell. 2021 May 27;184(11):2843-2859.e20. doi: 10.1016/j.cell.2021.04.020. Epub 2021 May 14. PMID: 33991488.

2. Doumpas N, Söderholm S, Narula S, Moreira S, Doble BW, Cantù C, Basler K. TCF/LEF regulation of the topologically associated domain ADI promotes mESCs to exit the pluripotent ground state. Cell Rep. 2021 Sep 14;36(11):109705. doi: 10.1016/j.celrep.2021.109705. PMID: 34525377.

3. Zhao B, Yu X, Shi J, Ma S, Li S, Shi H, Xia S, Ye Y, Zhang Y, Du Y, Wang Q. A stepwise mode of TGFβ-SMAD signaling and DNA methylation regulates naïve-to-primed pluripotency and differentiation. Nat Commun. 2024 Nov 22;15(1):10123. doi: 10.1038/s41467-024-54433-5. PMID: 39578449; PMCID: PMC11584862.

 

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