干细胞&小分子化合物系列 | 诱导血液干细胞（HSCs）案例指南
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2026-05-15
一、实验原理
穿心莲内酯（AP）可通过激活Wnt/β-catenin、Notch等干细胞自我更新相关信号通路，抑制CD34⁺HSC分化，促进其体外增殖，同时维持细胞干性及多谱系分化能力；通过无血清+细胞因子基础体系，结合AP干预，实现HSC高效、安全的体外扩增。
二、实验材料与试剂
实验材料：人脐带血样本（新鲜，采集后4h内处理）
实验所用的小分子：
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试剂名称 |
货号 |
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53693ES |
Andrographolide穿心莲内酯（AP）储存液：称取适量AP（货号53693ES），用甲醇溶解，配制浓度为10 mM的储存液，0.22 μm滤器过滤除菌，分装至无菌EP管，-80℃保存，避免反复冻融（最多冻融3次）
实验器材：
1.细胞培养类：低吸附6孔板、96孔板、无菌离心管（15 mL、50 mL）、移液枪（10 μL、100 μL、1000 μL）及无菌枪头；
2.分选类：磁性分选架（与磁珠试剂盒配套）、流式细胞仪；
3.培养类：CO₂培养箱（37℃、5% CO₂、饱和湿度）；
4.其他：生物安全柜、离心机、光学显微镜（10×物镜）、-80℃冰箱、酶标仪、无菌操作台。
实验步骤：
一、实验前准备：
（1）细胞准备：将新鲜脐带血经PBS稀释、离心获取细胞沉淀，通过预富集、密度梯度离心分离出白膜层细胞，经洗涤重悬后进行CD34⁺磁珠分选，最后通过台盼蓝染色与流式细胞术完成细胞活力（≥95%为合格）及纯度（≥90%）质控，获得合格目标细胞。
（2）穿心莲内酯(Andrographolide,AP)最佳剂量筛选：
1.细胞接种：将分选合格的CD34⁺细胞用无血清培养基调整密度至1000 cells/well，接种于96孔低吸附培养板，每孔体积100μL；
2.分组处理：设置AP浓度梯度（如0 μM、1 μM、2.5 μM、5 μM、10 μM），每组设置3个复孔；同时设置甲醇溶剂对照（与最高浓度AP组的甲醇浓度一致）；
3.确定最佳浓度：将96孔板放入CO₂培养箱，37℃、5% CO₂、饱和湿度培养，期间不换液；分别在培养第3天、第5天、第7天，测定每孔OD值，筛选出无明显毒性、且增殖效果最优的AP浓度，用于后续扩增实验。
二、CD34⁺HSC体外扩增培养
1.细胞接种：将分选合格的CD34⁺细胞用对应组完全培养基（对照组/AP实验组）调整密度至1×10⁵ cells/mL，接种于6孔低吸附培养板，每孔体积2mL，每组设置3个复孔；
2.初始培养：将培养板放入CO₂培养箱，37℃、5% CO₂、饱和湿度培养，培养前2天不进行任何处理；
3.半量换液：第3天开始，每3天进行一次半量换液（即吸弃1mL旧培养基，加入1mL新鲜的对应组完全培养基），换液时动作轻柔，避免吹散细胞聚团，补加AP及细胞因子至对应终浓度；
4.动态观察：每天在光学显微镜下（10×物镜）观察细胞形态、聚团情况，记录细胞生长状态，若出现污染（如培养基浑浊、出现异常菌落），立即终止该孔实验；
5.样本收集：分别在培养第3天、第5天、第7天，每组取1孔细胞，收集细胞悬液，用于后续活力、增殖、表型检测。
实验检测
根据实验设计（活力检测、BrdU流式法、流式细胞术、细胞形态、集落形成实验）进行试验检测
实验结果
穿心莲内酯（AP）在2.5 μM、5 μM 浓度下，可显著促进人脐带血CD34⁺ HSC体外增殖，有效维持细胞干性及多谱系分化能力，且无明显细胞毒性，其作用机制与激活Wnt/β-catenin、Notch信号通路相关，可用于CD34⁺ HSC体外扩增实验及后续相关研究。
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