干细胞&小分子化合物系列 | 猪胚胎干细胞培养全流程指南
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2026-04-29
背景介绍
随着生命科学与农业生物技术深度融合，猪胚胎干细胞（pESCs）凭借在家畜价值与医学模型上的双重潜力，以及细胞增殖、多向分化、基因编辑耐受性等优势，成为全球科研热点。依托技术迭代，猪胚胎干细胞培养已实现从难以建系到稳定传代、从单一应用到多领域赋能的突破，可用于家畜育种、人类疾病模型、细胞培肉与再生医学等方向。
猪胚胎干细胞是从猪早期胚胎上胚层分离的多能干细胞，具备体外无限增殖、自我更新和多向分化潜能，培养核心是模拟体内发育微环境、维持多能性。近年来国内外团队攻克了建系困难、传代不稳定、不耐受基因编辑等难题，其中中国农业大学韩建永教授团队建立了目前世界上传代次数最高（260 次以上）的猪胚胎干细胞系。
相比传统体系，如今优化后的培养技术更稳定、更实用，关键在于小分子化合物、生长因子与培养耗材的精准组合与创新应用。
猪胚胎干细胞培养所需的化合物、生化试剂、细胞因子、耗材等：
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产品名称 |
货号 |
核心用途 |
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CHIR-99021 |
Wnt信号通路激活剂，维持pESCs多能性，优化后推荐用于3iLAF培养体系 |
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Y-27632 |
ROCK抑制剂，抑制pESCs凋亡，提升单细胞分离后的存活率 |
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Y-27632 dihydrochloride |
Y-27632盐酸盐形式，水溶性更优，适用于pgEpiSCs培养体系 |
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A 83-01 |
TGF-β信号通路抑制剂，抑制pESCs分化，维持多能性状态 |
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激活素A（Activin A） |
维持猪上胚层多能性关键因子，促进pESCs自我更新 |
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重组猪成纤维细胞生长因子-2 |
促进pESCs增殖，参与猪上胚层多能性调控，是pgEpiSCs培养必需因子 |
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胎牛血清（FBS） |
提供营养物质，维持pESCs稳态，推荐使用5%-10%浓度 |
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N-乙酰半胱氨酸 |
抗氧化剂，减少pESCs培养过程中的氧化损伤，提升细胞活力 |
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HEPES溶液（1 M），细胞培养级 |
维持培养基pH稳定，适配pESCs体外培养微环境 |
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基质胶（Matrigel） |
模拟体内细胞外基质，促进pESCs贴壁生长，维持多能性形态 |
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金属浴 |
用于试剂溶解、细胞孵育，保障培养过程中温度精准控制 |
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血清移液管（5mL） |
用于细胞悬液转移、培养基分装，避免细胞损伤 |
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15mL/50mL无菌锥形离心管 |
用于pESCs离心沉淀、细胞重悬，保障无菌操作 |
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24孔板，无菌 |
用于pESCs复苏、传代培养，适配小规模培养需求 |
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针头过滤器（0.22um，无菌） |
用于培养基、试剂过滤除菌，避免污染影响pESCs培养 |
培养方案
一. 猪胚胎干细胞的复苏
1、将储存有pgEpiSCs的冻存管从液氮中取出，迅速置于37℃水浴锅中，轻轻晃动2-3分钟，确保细胞悬液快速解冻（避免反复冻融损伤细胞）。
2、将解冻后的细胞悬液缓慢转移至15 mL无菌锥形离心管中，加入5 mL预温至37℃的猪胚胎干细胞基础培养基，用血清移液管轻轻吹打2-3次，轻柔重悬细胞，避免剧烈吹打导致细胞破裂。
3、设置离心机参数为500 g，离心3分钟，使pgEpiSCs充分沉淀，随后缓慢弃去上清液（注意保留管底少量液体，避免吸走细胞）。
4、加入2 mL含10 μM Y-27632（Cat# 53006ES）或Y-27632 dihydrochloride（Cat# 52604ES）和10%胎牛血清FBS（40131ES或40132ES）的复苏培养基，用血清移液管吹打2-3次，充分吹散细胞团，确保细胞均匀分散。
5、将重悬后的pgEpiSCs转移至铺有基质胶的24孔板中，每孔加入适量复苏培养基，轻轻晃动培养板，使细胞均匀分布。
6、将24孔板放入37℃、5% CO₂的细胞培养箱中，静态孵育30分钟，使细胞贴壁。
7、孵育完成后，更换为新鲜的pgEpiSCs专用培养基（含CHIR-99021（Cat# 53003ES）、激活素A（Cat# 91708ES）、FGF-2（Cat# 91330ES）等关键因子），继续放入培养箱培养，24小时后观察细胞贴壁及生长状态。
1、细胞复苏后，每2天更换一次新鲜的pgEpiSCs专用培养基，更换时弃去孔内废液，用PBS缓冲液轻轻冲洗细胞表面1次，避免残留废液影响细胞生长。
2、培养过程中，每日在显微镜下观察细胞形态：正常pgEpiSCs呈克隆状生长，形态规整、边界清晰，细胞核大而透亮，无明显分化迹象；若出现细胞形态不规则、边界模糊，需及时调整培养基成分（如增加激活素A（Cat# 91708ES）浓度）。
3、培养环境需严格控制：温度维持在37±0.5℃，CO₂浓度为5%，湿度保持在95%以上，避免温度波动或CO₂浓度异常导致细胞分化。
4、为维持细胞多能性，可每3天加入一次抗氧化剂（N-乙酰半胱氨酸，Cat# 50303ES），减少细胞培养过程中的氧化应激损伤，提升细胞增殖活力。
5、连续培养7-10天后，细胞克隆达到一定密度（每孔约80%-90%汇合度），即可进行传代操作，避免细胞过度汇合导致分化。
1、传代前，提前将pgEpiSCs专用培养基、胰酶消化液、PBS（Cat# 41403ES）缓冲液预温至37℃。
2、弃去24孔板内的旧培养基，用PBS（Cat# 41403ES）缓冲液轻轻冲洗细胞表面2次，彻底去除残留培养基。
3、每孔加入适量胰酶（Cat# 40127ES）消化液，放入37℃培养箱中孵育3-5分钟，在显微镜下观察细胞形态，当细胞出现皱缩、间隙增大时，立即加入含10%胎牛血清的培养基终止消化。
4、用血清移液管轻轻吹打细胞表面，使细胞脱离培养皿并分散成单细胞悬液，吹打时动作轻柔，避免产生气泡损伤细胞。
5、将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中，500 g离心3分钟，弃去上清液，加入新鲜的pgEpiSCs传代培养基（含2-5 μM CHIR-99021（Cat# 53003ES））重悬细胞。
6、将重悬后的细胞按1:3的比例接种至新的铺有基质胶的24孔板中，加入适量传代培养基，轻轻晃动培养板使细胞均匀分布。
7、将培养板放入细胞培养箱中继续培养，24小时后观察细胞贴壁情况，48小时后更换新鲜培养基。
8、若需进行基因编辑操作，可在传代后24小时进行（此时细胞活力最佳），pgEpiSCs可耐受3次连续基因编辑，编辑后细胞仍可维持多能性并正常增殖。
图1. 利用猪原肠胚前上胚层干细胞（pgEpiSCs）多轮基因编辑制备基因编辑克隆猪的技术流程[4]
参考文献
1. Eicher AK, Kechele DO, Sundaram N, Berns HM, Poling HM, Haines LE, Sanchez JG, Kishimoto K, Krishnamurthy M, Han L, Zorn AM, Helmrath MA, Wells JM. Functional human gastrointestinal organoids can be engineered from three primary germ layers derived separately from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2022 Jan 6;29(1):36-51.e6. doi: 10.1016/j.stem.2021.10.010. Epub 2021 Dec 1. PMID: 34856121; PMCID: PMC8741755.
2. Wang J, Xie W, Li N, Li W, Zhang Z, Fan N, Ouyang Z, Zhao Y, Lai C, Li H, Chen M, Quan L, Li Y, Jiang Y, Jia W, Fu L, Mazid MA, Zhu Y, Maxwell PH, Pan G, Esteban MA, Dai Z, Lai L. Generation of a humanized mesonephros in pigs from induced pluripotent stem cells via embryo complementation. Cell Stem Cell. 2023 Sep 7;30(9):1235-1245.e6. doi: 10.1016/j.stem.2023.08.003. PMID: 37683604.
3. Zhu G, Gao D, Li L, Yao Y, Wang Y, Zhi M, Zhang J, Chen X, Zhu Q, Gao J, Chen T, Zhang X, Wang T, Cao S, Ma A, Feng X, Han J. Generation of three-dimensional meat-like tissue from stable pig epiblast stem cells. Nat Commun. 2023 Dec 9;14(1):8163. doi: 10.1038/s41467-023-44001-8. PMID: 38071210; PMCID: PMC10710416.
4. Zhi M, Zhang J, Tang Q, Yu D, Gao S, Gao D, Liu P, Guo J, Hai T, Gao J, Cao S, Zhao Z, Li C, Weng X, He M, Chen T, Wang Y, Long K, Jiao D, Li G, Zhang J, Liu Y, Lin Y, Pang D, Zhu Q, Chen N, Huang J, Chen X, Yao Y, Yang J, Xie Z, Huang X, Liu M, Zhang R, Li Q, Miao Y, Tian J, Huang X, Ouyang H, Liu B, Xie W, Zhou Q, Wei H, Liu Z, Zheng C, Li M, Han J. Generation and characterization of stable pig pregastrulation epiblast stem cell lines. Cell Res. 2022 Apr;32(4):383-400. doi: 10.1038/s41422-021-00592-9. Epub 2021 Nov 30. PMID: 34848870; PMCID: PMC8976023.
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