实验所用产品

产品货号	产品名称
40192ES	基质胶 Ceturegel® Matrix,Phenol Red-Free,LDEV-Free Plus(同康宁matrigel胶)

 

1. 样本制备

小鼠断颈处死，表面喷洒酒精杀菌。在无菌环境下截取出近肛门端处3 - 15 cm结肠组织，用镊子小心去除肠道外部的肠系膜、脂肪后，放入4℃预冷的含1%双抗DPBS溶液中。

2. 样本清洗

使用注射器冲洗肠道2 - 3次。用手术剪将肠管小心剪开，肠腔面朝上，用手术刀片轻轻刮去肠腔表面肠绒毛，待肠绒毛被刮净后（呈现组织透明），将肠组织置于新的含DPBS的培养皿中清洗2 - 3次。

3. 样本处理

将清洗后的结肠组织剪碎至2 mm大小的块状体，顺势转移至新的50 mL离心管中，用DPBS轻柔清洗3 - 5次，除去肠绒毛细胞和漂浮脂肪组织。

4. 样本消化

在结肠组织碎片中加入10 - 15 mL含有3 - 5 mM EDTA的预冷DPBS中消化，4℃孵育30 min左右，期间每10 min轻摇一次离心管。

5. 洗涤

消化完成后，弃去EDTA消化液上清，用新的DPBS缓冲液将组织轻柔漂洗2 - 3次以去除剩余的EDTA。

6. 收集细胞悬液（第一次）

在结肠组织碎片中加入10 - 15 mL预冷的含0.1% BSA的DPBS，反复吹打、重悬组织碎片，使隐窝与基底层分离。取少许悬液镜检，当发现有隐窝样结构后停止吹打。将吹打后的组织悬液使用70 μm滤网过滤，收集穿过滤网的隐窝悬液。

7. 洗涤与离心

将收集的悬液以1500 rpm、4℃离心3 min，弃上清。

8. 重复收集与离心

向离心管中的组织沉淀再次加入10 - 15 mL预冷的含0.1% BSA的DPBS，重复步骤6的吹打、过滤操作，收集滤液后以相同条件离心。共进行两次，合并两次离心所得的隐窝沉淀。

9. 混合物形成

用Ceturegel®基质胶重悬隐窝组织沉淀，调整浓度使每10 μL基质胶悬液包含200 - 600个隐窝。重悬后混合液置于冰上，尽快操作以避免基质胶形成凝胶。

10. 铺板

将混合悬液种植于24孔板底部正中央，每孔30 - 50 μL，避免悬液接触孔板侧壁。将种植后的培养板置于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育30 min左右待Ceturegel®基质胶凝固。

11. 培养

待基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的小鼠结肠类器官生长培养基，每孔800 μL直至完全浸没混合物。将24孔板置于37℃二氧化碳培养箱中培养。每3天更换一次新鲜培养基并观察类器官生长状态，一般小鼠结肠类器官在5 - 7天内形成。

图1：Day2培养情况	图2：Day4培养情况

（数据来源：武汉协和医院金银湖院）

 

类器官构建实验小贴士

1.样本处理：无菌操作，快速剔除坏死组织，保持样本低温，确保起始细胞活性。

2.消化过程：严格控制消化液浓度、温度与时间，通过镜检及时终止，避免过度消化。

3.基质胶操作：全程冰上操作，快速重悬与铺板，防止胶体凝固，确保点胶位置居中。

4.培养维持：使用新鲜培养基，定期轻柔换液，保持培养环境稳定，勤于镜检观察形态。

 

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