实验所用产品

产品货号	产品名称
40186ES	Ceturegel®基质胶(GFR/不含酚红/不含LDEV)(同康宁matrigel胶)

 

一、实验前准备与基质胶铺板

基质胶解冻：实验前，将Ceturegel®基质胶从-20℃或-80℃冰箱取出，转移至4℃冰箱过夜，使其完全解冻。

器材预冷与消毒：准备一盒4℃预冷的枪头用于吸取基质胶。实验开始前，将24孔板放置于冰盒中，一同置于紫外灯下照射消毒。

基质胶稀释：根据产品说明，用不含双抗和FBS的DMEM高糖培养基对基质胶进行稀释。

铺板与预处理：将完全解冻的基质胶放于冰盒上，轻轻翻转几次混匀。取出预冷的枪头与24孔板置于冰上，使用200 μL枪头向每孔中加入 10-20 μL 稀释后的冷基质胶。用枪头轻轻将胶抹开成圆形，注意不要碰到孔板边缘，避免胶体浪费。在24孔板间隙加入PBS，以防止培养基蒸发。将铺胶后的24孔板放入干净的密封袋中，置于4℃冰箱过夜。

凝胶固化：过夜处理后（约12小时），取出24孔板，转移至37℃、5% CO₂ 的细胞培养箱中，静置 30分钟，以促进凝胶聚合和稳定。

二、HUVEC细胞准备与接种

细胞来源与状态：使用3-5代、状态良好的HUVEC细胞，实验前24小时细胞密度达到约80%。

细胞饥饿处理：将完全培养基置换为仅含0.2% FBS的DMEM培养基，培养24小时进行饥饿处理，使细胞周期同步化。

细胞消化与重悬：饥饿处理结束后，吸去培养液上清，用PBS清洗细胞。加入含EDTA的胰蛋白酶溶液进行消化，解除细胞间粘连。收集细胞悬浮液，通过细胞计数仪进行精确计数。使用含10% FBS的DMEM培养基重悬细胞。

细胞接种：将细胞悬液以每孔 1.5×10⁵个 细胞、500 μL/孔的浓度接种到预先凝固的凝胶基底上。接种时注意保持枪头垂直，缓慢加入细胞悬液，避免冲击力损伤凝胶材料。轻轻晃动孔板使细胞分布均匀。

三、培养、观察与表型记录

孵育：将接种细胞的24孔板置于37℃、5% CO₂ 培养箱中继续培养。

动态观察：在接种后的 2、4、6、8小时 等时间点，使用倒置显微镜观察HUVEC成管情况。应详细记录细胞贴壁伸展、线性连接、管状网络形成等关键形态学变化的时间点。

四、实验结果

图1：2h培养情况	图2：4h培养情况	图3：6h培养情况

（数据来源：重庆医科大学）

 

血管生成实验小贴士

细胞状态：推荐使用3-5代细胞，可进行血清饥饿同步化；

基质胶：全程冰上操作，铺胶轻柔均匀；
细胞接种：使用单细胞悬液，并精确计数，轻柔加样；

观察：建议通过预实验确定最佳观察时间点，以捕获网络成熟期。