实验所用产品：

产品货号	产品名称
40183ES	Ceturegel基质胶(同matrigel基质胶,BD基质胶,康宁基质胶)

 

一、Transwell小室基底膜制备

基质胶解冻与耗材预冷：提前将Ceturegel基质胶于4°C冰箱过夜解冻。实验全程置于冰上操作，并使用预冷枪头及离心管，以避免基质胶提前凝胶化。

基质胶稀释与铺胶：用预冷的无血清培养基将基质胶按 1:8 比例稀释，始终在冰上操作。每个Transwell小室（8 μm孔径聚碳酸酯膜）上室加入 约50 μL 稀释后的基质胶，轻轻晃动小室使其均匀覆盖整个膜面，注意避免产生气泡。

凝胶化：将铺胶后的小室置于37°C、5% CO₂培养箱中，孵育 30~60分钟，待基质胶完全凝固。

二、实验细胞准备

细胞给药处理：取处于对数生长期、融合度控制在70%~80%的4T1细胞，按既定分组方案在6孔板中加入纳米材料，处理 24小时。

细胞悬液制备：给药结束后，用PBS轻柔清洗细胞1次。加入胰酶消化细胞，收集细胞悬液至离心管，1000 rpm离心约3分钟。弃上清，用无血清培养基重悬细胞并轻柔吹打使其分散均匀。进行细胞计数，并调整细胞浓度至 约2×10⁵个/mL，确保各组上样细胞数一致。

三、细胞接种与共培养

建立趋化梯度：在24孔板的下室加入 600~800 μL 含 10% FBS 的完全培养基作为趋化因子来源，使上室无血清环境与下室含血清环境形成稳定的趋化梯度。

关键提示：加液时沿孔壁缓慢加入，避免震动Transwell，同时防止液体溅起接触上室膜面造成梯度不稳定。

接种细胞：取调整好密度的各组细胞悬液，混匀后向每个Transwell上室加入 200 μL（即含约 4×10⁴个细胞）。上样后轻放小室，以免液体冲击膜面或破坏已凝固的基质胶层，同时检查上室无气泡且液面覆盖均匀。

孵育培养：将装好细胞的Transwell孔板置于37°C、5% CO₂培养箱中孵育 24小时。孵育期间尽量减少搬动与震动。

四、固定、染色与结果分析

去除未穿膜细胞：孵育结束后，小心弃去上、下室培养基。用PBS轻柔清洗1~2次后，使用湿润棉签沿同一方向轻轻擦拭上室膜面，将上室未侵袭的细胞去除。擦拭力度需一致且避免戳破膜或刮掉基质胶残留。

固定：在下室加入 4% 多聚甲醛，固定 15~20分钟。弃去固定液，用DPBS清洗2次。

染色与漂洗：加入 0.1% 结晶紫染色液，染色 20分钟。染色结束后用流水轻柔清洗（或直接将小室浸泡在PBS烧杯中）直至背景清晰。将Transwell置于通风处室温晾干，确保膜面干燥。

细胞计数与数据分析：将Transwell膜下表面（穿膜细胞所在面）置于显微镜下观察。每孔随机选择5个不重复的视野进行拍照记录，并对每个视野的穿膜细胞数进行计数，取每孔5个视野的平均值，汇总各复孔平均值后计算组间差异。

实验结果：经实验处理后，穿膜细胞数减少，表明该处理抑制了4T1细胞的侵袭。

 

图：细胞侵袭实验结果

（数据来源：电子科技大学）

 

细胞侵袭实验小贴士

1.铺胶：基质胶铺制需全程冰上操作，枪头、离心管等耗材应提前预冷，以防胶体在操作过程中提前聚合，导致铺胶不均，影响屏障均一性。

2. 细胞：细胞需经充分无血清饥饿，以消除血清背景干扰。接种密度应通过预实验精确优化。

3. 气泡：组装小室与培养板时，务必检查并确保小室底部膜与下室含趋化剂的培养液之间无气泡。

4. 培养：侵袭培养时间因细胞类型而异，需通过预实验确定（通常12-48小时）。

5. 擦拭：用棉签擦拭上室未侵袭细胞时，动作必须轻柔、一致，且仅擦拭一次。

6. 计数：应在显微镜下随机选择至少5个不重叠的视野（避开膜边缘区域）进行计数，取平均值。

 

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