实验所用产品：

产品货号	产品名称
40183ES	Ceturegel基质胶(同matrigel基质胶,BD基质胶,康宁基质胶)

 

一、Transwell小室基底膜制备

基质胶解冻与稀释：将Ceturegel®基质胶从-20°C取出，置于冰盒上，于4°C冰箱过夜溶解。溶解后，用预冷的基础培养基按 1:5 比例稀释（终浓度不超过3 mg/mL），全程冰上操作。

铺胶与凝胶化：取稀释后的基质胶，均匀铺于Transwell小室的上室面，注意避免气泡。将小室置于37°C培养箱中，静置 30分钟 至 8小时（通常30分钟至1小时即可），使基质胶充分凝固。

水化：使用前，向上室加入无血清培养基，于37°C培养箱中水化 30分钟。水化结束后小心吸弃培养基。
注：若进行迁移实验，则无需包被基质胶，但需提前将小室从75%乙醇中取出，倒扣于超净台内吹干备用。

二、实验细胞准备与预处理

细胞饥饿：在实验前 12-24小时，将生长状态良好的细胞更换为无血清培养基进行饥饿处理，以消除血清影响。

药物预处理：在6孔板中对细胞进行相应的药物处理，将6孔板置于培养箱中培养 48小时。

三、细胞接种与共培养

制备细胞悬液：吸弃6孔板中的完全培养基，用PBS洗涤1-2遍。加入胰酶消化约1分钟，用含血清的培养基终止消化并吹打收集细胞。800 r/min离心3-5分钟。弃上清，用基础培养基重悬细胞，使用血球计数板计数，调整细胞密度至 1×10⁵个/mL。
*计数公式：细胞数/mL =（80格中的细胞数 / 80）× 400 × 10000*

接种细胞：用镊子夹取包被好的Transwell小室，置于24孔板中。取含 1×10⁵个细胞 的细胞悬液，用基础培养基补齐至 200 μL，轻轻加入小室上室。

建立趋化梯度：在24孔板的下室加入 600 μL 含血清的完全培养基（作为趋化剂）。

关键提示：放置小室时需确保下室培养液与小室底部之间无气泡，否则会阻断趋化作用。

孵育培养：将培养板置于37°C、5% CO₂培养箱中，培养 约16小时（具体时间需根据细胞的迁移/侵袭能力预实验确定）。

四、固定、染色与结果分析

清洗与去除未穿膜细胞：培养结束后，取出Transwell小室。在24孔板中加入600 μL PBS，将小室放入清洗2次，每次置于摇床上5分钟。第二次清洗完毕后，用棉签蘸取75%酒精，非常轻柔地擦拭小室的上层，以彻底擦除未穿膜的细胞。

固定与通透：用 4% 多聚甲醛（600 μL/孔）将细胞固定于小室下层，室温浸泡 20分钟。随后用PBS清洗2次，每次5分钟。将 100% 甲醇（600 μL/孔）加入24孔板中，将小室浸入其中 20分钟 以通透细胞膜，再用PBS清洗2次。

DAPI染色：每孔加入 600 μL DAPI 染色液（用PBS按 1:100 比例稀释），避光染色 15分钟。染色后用PBS清洗2次，每次5分钟。

观察与拍照：将Transwell小室颠倒放置于盖玻片上，使用正置荧光显微镜在 10× 或 20× 倍镜下观察并拍照。

数据统计：计数每组视野中的穿膜细胞数，计算平均值。

侵袭抑制率计算公式为：侵袭抑制率 =（对照组侵袭细胞数 - 实验组侵袭细胞数）/ 对照组侵袭细胞数 × 100%。以此量化药物处理对细胞侵袭能力的影响。

实验结果：随着接种时间的推移，穿膜的细胞逐渐增多。

图1：接种6h	图2：接种24h	图3：接种48h

（数据来源：天津科技大学）

 

细胞侵袭实验小贴士

1.铺胶：基质胶铺制需全程冰上操作，枪头、离心管等耗材应提前预冷，以防胶体在操作过程中提前聚合，导致铺胶不均，影响屏障均一性。

2. 细胞：细胞需经充分无血清饥饿，以消除血清背景干扰。接种密度应通过预实验精确优化。

3. 气泡：组装小室与培养板时，务必检查并确保小室底部膜与下室含趋化剂的培养液之间无气泡。

4. 培养：侵袭培养时间因细胞类型而异，需通过预实验确定（通常12-48小时）。

5. 擦拭：用棉签擦拭上室未侵袭细胞时，动作必须轻柔、一致，且仅擦拭一次。

6. 计数：应在显微镜下随机选择至少5个不重叠的视野（避开膜边缘区域）进行计数，取平均值。

 

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