实验所用产品：

产品货号	产品名称
40183ES	Ceturegel基质胶(同matrigel基质胶,BD基质胶,康宁基质胶)

 

一、Transwell小室基底膜制备

基质胶稀释：将Ceturegel®基质胶于4°C过夜完全融化，所有操作在冰上进行。用预冷的无血清DMEM培养基按 1:8 比例进行稀释，轻柔混匀。

铺胶与凝胶化：立即用预冷枪头吸取 50 μL 稀释后的基质胶，均匀铺于Transwell小室上室的聚碳酸酯膜表面，注意避免产生气泡。将小室置于37°C、5% CO₂培养箱中，孵育 4小时，使基质胶完全凝固形成人工基底膜。

二、实验细胞准备

细胞收集：取对数生长期的AN3CA细胞及临床原代EC细胞。

细胞悬液制备：用无血清培养基重悬细胞，计数后调整细胞浓度至 5×10⁵个/mL。

三、细胞接种与共培养

建立趋化梯度：在24孔板的下室加入 600 μL 含 10% 胎牛血清 的对应培养基（作为趋化因子）。

接种细胞与药物处理：取 200 μL 细胞悬液（即含 1×10⁵个细胞）加入Transwell小室的上室，同时按实验分组在上室中加入对应浓度的药物。

关键提示：确保小室底部膜与下室液体之间无气泡，否则会阻断趋化作用。

孵育培养：将组装好的培养板置于37°C、5% CO₂培养箱中，常规培养 24小时。

四、固定、染色与结果分析

固定：培养结束后，取出Transwell小室，弃去上下室培养液。

关键步骤：用湿润的棉签，非常轻柔地擦拭上室膜表面，以彻底去除未侵袭的细胞及残留的基质胶。将小室浸入 4% 多聚甲醛 中，室温固定 30分钟。

固定后，用PBS洗涤小室2次。

染色与漂洗：将小室浸入 0.1% 结晶紫染色液 中，室温染色 20分钟。染色后，用PBS洗涤小室3次，以去除多余染色液。

细胞计数与数据分析：将小室适当风干后，置于倒置显微镜下，在 10× 物镜 下观察。每孔随机选取5个视野进行拍照，并计数每个视野中穿过膜并被染色的细胞数。

实验结果：随着药物处理后，穿膜细胞数减少，表明该药物对AN3CA细胞侵袭有抑制作用。

 

图1：实验组	图2：对照组

（数据来源：同济大学）

 

细胞侵袭实验小贴士

1.铺胶：基质胶铺制需全程冰上操作，枪头、离心管等耗材应提前预冷，以防胶体在操作过程中提前聚合，导致铺胶不均，影响屏障均一性。

2. 细胞：细胞需经充分无血清饥饿，以消除血清背景干扰。接种密度应通过预实验精确优化。

3. 气泡：组装小室与培养板时，务必检查并确保小室底部膜与下室含趋化剂的培养液之间无气泡。

4. 培养：侵袭培养时间因细胞类型而异，需通过预实验确定（通常12-48小时）。

5. 擦拭：用棉签擦拭上室未侵袭细胞时，动作必须轻柔、一致，且仅擦拭一次。

6. 计数：应在显微镜下随机选择至少5个不重叠的视野（避开膜边缘区域）进行计数，取平均值。

 

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