基因测序是探索生命奥秘的核心手段，从一代测序的逐碱基解析，到二代测序的高通量并行，测序技术的迭代始终朝着更快速、更精准、更高效的方向迈进。三代测序技术作为新一代测序技术的核心代表，以“单分子测序”和“长读长”为核心突破，彻底解决了前两代测序在长片段解析、复杂基因组拼接中的短板，为基因组学研究、临床诊断等领域带来了革命性变革。

一、核酸提取

核酸（DNA或RNA）是测序的核心原料，三代测序对核酸的质量要求远高于前两代技术，由于三代测序是直接对单个核酸分子进行测序，因此核酸样品的完整性、纯度和浓度直接影响后续测序的准确性与读长。与二代测序不同，三代测序更偏好高分子量的核酸分子，尤其是DNA样品，理想片段长度需达到10kb以上，才能充分发挥其长读长的优势。

图提取的DNA的琼脂糖凝胶电泳图

核酸提取完成后，需要进行质检，质检合格后，再进行文库构建。

质检标准表

QC指标	方法建议	QC标准	常见问题和解决建议
片段大小	琼脂糖凝胶电泳（常用、便捷）；Agilent分析仪（更精准）	条带清晰未降解	条带降解，重新提取或者风险建库
纯度	Nonodrop等分光光度仪器	A260/280 比值 1.8 - 2.0，A260/230 比值 ≥2.0.	A260/280比值过低，代表有蛋白、酚类等污染，可以通过 AMPure 纯化来解决，比值过高通常还好。A260/230 比值过低，可能有碳水化合物、酚类、胍类、糖原残留。A260/230 比值过高建议重新做空白校正（仪器没擦干净或者用于空白校正的水被污染）。
核酸浓度	Qubit	至少要大于0.01ng/uL，具体要看应用方向。	如果测算的 NanoDrop 浓度值显著的不同于 (>50%) Qubit 的测算值，PacBio 建议进行 AMPure 纯化步骤，如果一次 AMPure 纯化步骤无法解决测量差异问题，可以用其他方法再次纯化。

二、文库构建

文库构建是连接核酸样品与测序仪器的关键桥梁，其核心目的是对提取的核酸分子进行修饰，使其能够被测序仪器识别和检测。

三代测序的文库构建流程简洁高效，不同平台（PacBio、Oxford Nanopore）的具体步骤略有差异，但核心环节一致，主要包括末端修复、接头连接和纯化三步：

图文库构建基本流程（以pacbio平台为例）

DNA打断（可选）：DNA是否打断取决于测序目的和测序仪器，所以是可选的，一般采用机械的打断方法。
片段修复：由于提取的核酸分子末端可能存在断裂、突出等不完整结构，需通过末端修复酶修复这些缺陷，使核酸分子形成平末端或粘性末端，为后续接头连接做准备。对于DNA样品，末端修复还会去除末端的磷酸基团，避免自身环化；对于RNA样品，需先进行逆转录得到cDNA，再进行末端修复。
连接接头：这是文库构建的核心步骤。接头是一段人工合成的短核酸序列，分为测序接头和索引接头，测序接头负责与测序仪器的纳米孔或测序芯片结合，索引接头则用于区分不同样本的文库（便于多样本混合测序）。值得注意的是，不同平台的接头不可互换，需使用对应试剂盒提供的专用接头。
文库片段纯化和分选：连接完成后，需通过磁珠纯化去除未连接的接头、酶以及其他杂质，避免这些物质干扰测序过程。纯化过程中，通过调整PEG和NaCl的浓度，实现对目标长度文库片段的富集，确保文库片段长度符合测序要求——对于PacBio SMRT平台，文库片段长度通常为10-20kb；对于Oxford Nanopore平台，可实现更长片段的富集，甚至达到百万碱基级别。纯化后的文库需再次定量，确保浓度和长度符合上机要求，随后可进行测序，或置于4℃短期保存或-20℃长期保存。

三、测序

测序过程是将文库中的核酸分子序列转化为可读取信号的核心环节，三代测序分别以PacBio SMRT技术和Oxford Nanopore纳米孔技术为代表，两者原理不同，但均能实现对单分子核酸的直接测序。

PacBio SMRT技术（单分子实时测序）的核心原理是“荧光实时检测”。该技术的测序速度可达每秒10个碱基，是化学法测序的2万倍，且一个反应可读取数千至上万个碱基的序列，精度高达99.9999%，还能直接检测甲基化的DNA序列和RNA序列。

Oxford Nanopore技术（纳米孔测序）的核心原理是“电信号检测”。由于不同碱基的带电性质和空间结构不同，会引起通过纳米孔的电流发生特异性变化，测序仪器实时捕捉这些电流变化，通过算法解析得到碱基序列。该技术的优势在于读长极长，可达到无限长（目前读长纪录已突破400kb），测序速度快，且可直接对RNA分子进行测序，无需逆转录为cDNA，大幅降低了系统误差。

测序结束后，原始数据需经过生物信息学分析（如去接头、去低质量序列、拼接组装等），最终得到完整的核酸序列。

四、总结

三代测序技术以其单分子测序、长读长、高精准的核心优势，打破了前两代测序技术的局限，成为基因组学研究、临床诊断、微生物检测等领域的核心技术。三代测序正逐步解码生命的奥秘，为人类健康和生命科学研究提供更强大的技术支撑。

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