质粒DNA纯化迷雾重重，这些关键要点你知晓几何？
什么是质粒纯化？
质粒纯化又称为质粒分离或质粒 DNA 分离，是指从细菌细胞中提取和纯化质粒 DNA，使科研人员获得高度浓缩和纯化的质粒形式，以便进一步分析和实验。质粒纯化的关键步骤通常包括细菌细胞裂解、去除细胞碎片、结合质粒 DNA、清洗、洗脱质粒 DNA 以及根据下游应用的可选附加步骤。
为什么质粒纯化如此重要？
质粒纯化至关重要，因为质粒DNA（pDNA）是基因工程中的基础工具，支持克隆、基因表达研究和治疗开发等应用。高质量的质粒DNA对于确保关键下游项目（如疫苗生产、细胞和基因治疗）的准确性和可靠性至关重要，有助于推动科学突破。
手动质粒纯化包含哪些关键步骤？
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收集细菌：离心20~30分钟；
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重悬、裂解、中和：在实验台上操作15~20分钟；
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澄清裂解液：使用离心机、注射器或真空装置5~10分钟；
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必要时，需要“去除内毒素”；结合、清洗、洗脱、沉淀：使用柱式或磁珠纯化，20~30分钟；
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重悬于溶液中：在实验台上操作5~10分钟。
质粒纯化考虑的因素？
质粒纯化有两个主要考虑因素：制备规模和纯度等级。这两者直接影响到下游应用的成功与否。从小规模研究到大规模治疗生产，常规的分子实验，一般对内毒素没有严格要求，转染实验对内毒素含量有要求，这些因素以及适当的纯度/内毒素水平——有助于确保获得适量的质粒DNA，从而实现可靠且可重复的预期结果。
质粒生长培养基如何选择？
质粒有不同的大小，包括小型（1–10 kb）、中型（10–50 kb）和大型（>50 kb）。质粒生长培养基，如LB肉汤、Terrific Broth (TB)、SOC培养基和2xYT，对于培养含有质粒的细菌细胞至关重要。这些营养丰富的培养基可以提高质粒产量，尤其对于大型质粒，优化细菌生长条件，并提高转化效率。
如何根据菌液量选择质粒提取试剂盒？
根据不同的菌液量，质粒提取试剂盒有小提，小中提，中提，大提；这些试剂盒又分为去内毒素和不去内毒素提取。
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小提 |
小中提 |
中提 |
大提 |
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过夜培养菌液体积 |
1–5 mL |
5-15 mL |
30-70 mL |
50-500 mL |
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大约产量 |
约40 µg |
30-90 µg |
100-500 µg |
0.5-4 mg |
质粒提取的纯度和内毒素等级有哪些？
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分子级：提供了速度和成本效益，使其非常适合克隆、核酸标记、PCR 和测序等稳健应用，
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转染级：专为需要更高纯度和更高产量的应用而设计，例如标准细胞系的转染和体外转录
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高级转染：如转染敏感细胞系或体内研究，推荐采用高级转染级质粒分离技术。
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纯度等级 |
分子级 |
转染级 |
高级转染级 |
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内毒素水平 |
>10 EU/µg |
0.1–1 EU/µg |
<0.1 EU/µg |
质粒DNA产量低或提取失败的原因?
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菌种活性不佳：如菌种保存时间过久，质粒可能丢失，建议培养前先划线活化，以稳定产量；如大肠杆菌太陈旧（低温下长期保存的菌等），建议重新涂板培养后挑选新菌落进行液体培养；
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未充分裂解细菌：细菌需充分重悬，成团的细菌会因无法裂解降低产量；
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裂解时间过长：导致质粒断裂，降解；
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质粒本身拷贝数低：载体因拷贝数差异会造成质粒产量明显的波动。高拷贝数的载体常有2-3倍的产量波动（每毫升培养过夜的菌液产量为3-16μg）；长片段质粒和表达型载体常以中低拷贝数为主，每毫升菌液的产量约为0.5-2μg；低拷贝质粒可以增加起始菌液量来提高浓度；
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菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。
质粒转染后细胞出现死亡或转染效果差，从质粒本身分析，原因可能有哪些？
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未使用去内毒素的质粒提取试剂盒：内毒素可与质粒DNA竞争转染试剂，阻碍质粒DNA进入细胞，从而极大程度地影响转染效率；同时，由于转染试剂会使细胞膜的通透性增加，内毒素进入细胞，导致细胞活力降低甚至引起死亡，则会进一步影响转染效率。建议选用添加有高效含内毒素清除因子的质粒提取试剂，以高效清除提取质粒中残存的内毒素。翌圣生物MolPure® Endo-free Plasmid Maxi Kit V2 无内毒素质粒大量提取试剂盒V2（19037ES），提取质粒内毒素水平 <1 EU/μg，可大幅提升细胞转染的效率。
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质粒纯度不够：在常规质粒提取试剂中，碱裂解法最为常用，但要注意其操作过程中，动作必须尽量温和，否则基因组DNA会由于剧烈操作而被破坏成小片段，在中和过程中被复性，保留在上清中随质粒DNA一同被回收，不仅会导致分光光度计测定的质粒DNA浓度值虚高、影响质粒提取的纯度，还会影响后续的转染效率。因此，质粒提取后进行琼脂糖凝胶电泳就显得非常有必要，可检测质粒中是否含有残留的基因组DNA或RNA，便于研究者对质粒质量有更好的把控。
产品选择指南
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系列 |
产品特点 |
产品名称 |
产品货号 |
产品形式 |
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磁珠法 |
菌液兼容量1-5 mL；得率高、纯度好 |
磁珠法质粒小量提取 |
18538ES |
瓶装 |
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18539ES |
板式 |
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18541ES |
板式 |
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菌液兼容量1-5 mL，内毒素≤1 EU/μg； |
磁珠法去内毒素质粒小量提取 |
18542ES |
瓶装 |
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菌液兼容量5-20 mL，内毒素≤1 EU/μg； |
磁珠法质粒去内毒素中量提取 |
18543ES |
瓶装 |
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18549ES |
板式 |
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柱法 |
菌液兼容量1-5 mL；得率高、纯度好 |
质粒小量提取 |
19001ES |
瓶装 |
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菌液兼容量1-5 mL，内毒素≤1 EU/μg； |
无内毒素质粒小量提取 |
19021ES |
瓶装 |
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菌液兼容量5-15 mL，内毒素≤1 EU/μg； |
无内毒素质粒小中量快速提取 |
19022ES |
瓶装 |
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菌液兼容量30-70 mL，内毒素≤1 EU/μg； |
无内毒素质粒中量快速提取 |
19023ES |
瓶装 |
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菌液兼容量200 mL，内毒素≤1 EU/μg； |
无内毒素质粒大量提取 |
19037ES |
瓶装 |
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菌液兼容量200 mL，内毒素≤0.01EU/μg； |
超纯无内毒素质粒大量提取 |
19038ES |
瓶装 |
