柱式法质粒提取的原理

柱式法质粒提取主要基于SDS-碱裂解法。细胞在高pH的强阴离子洗涤剂SDS作用下，细胞壁被裂解，染色体DNA和蛋白质发生变性并相互缠绕形成大型复合物。这些复合物在钾离子取代钠离子时从溶液中沉淀下来，而质粒DNA则留在上清液中。由于DNA带负电，质粒提取柱中的硅基质膜在高盐条件下能选择性地吸附DNA。通过去离子水洗脱，最终得到纯化的质粒DNA。

质粒提取的每种试剂关键成分是什么呢？今天我们来大揭秘

组分	关键成分和功能
缓冲液 RS*（P1）	关键成分:25mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA、50mM 葡萄糖功能:将菌体沉淀悬浮起来，有助于后续实验进行。注:在使用缓冲液 RS*之前，需要添加 RNase A，该酶的作用是降解溶液中的 RNA
裂解液 LB（P2）	关键成分:250mM NaOH、1%(W/V)SDS(十二烷基硫酸钠) 功能:细胞进行裂解
结合液 BD（P3）	关键成分:3M醋酸钾（potassium acetate）和5M醋酸功能:中和NaOH，并清除蛋白质等细胞内杂质
漂洗液 W*	关键成分:10mM Tris-HCl(pH7.5)、80%乙醇(Ethanol) 功能:去除DNA提取过程中产生的多余盐离子
洗脱液	关键成分:10mM Tris-HCl（pH7.5）的溶液功能:帮助DNA从硅胶柱中洗脱出来

质粒提取之后，如何评估质粒DNA的产量和质量呢？

目前使用分光光度法定量质粒DNA和通过琼脂糖凝胶电泳进行质粒DNA产率和质量的分析是两种最常用的方法。

举例：提取2 mL过夜培养的大肠杆菌PUC19质粒，分光光度法检测质粒的得率，在15 μg左右，260/280=1.8~2.0，260/230=2.0~2.3；琼脂糖凝胶电泳显示三条带，从上至下依次为：开环DNA、线性DNA、超螺旋DNA，其中超螺旋DNA的占比＞90%。

质粒提取常见问题案例梳理

出现严重的RNA污染

如图所示，质粒提取之后进行琼脂糖凝胶电泳，出现明显的RNA条带，说明有RNA污染。

原因及解决方法：

（1）未在缓冲液 RS*中事先加入RNase A。解决方法：补加RNase A。

（2）加入RNase A的缓冲液 RS*长期保存于室温，导致RNase A活性下降。解决方法：每次使用后置于 4℃保存。若长期不用，置于-20℃保存。

（3）细菌过量,RNase A不能有效降解RNA。解决方法：将细菌用量减半或增加RNase A在缓冲液 RS*中的浓度。

出现基因组污染

（1）菌体裂解和中和过程中,剧烈混合造成基因组DNA断裂所致。解决方法：温和地进行菌体的裂解和中和。

（2）加裂解液 LB时操作时间过长，造成基因组DNA断裂所致。解决方法：将裂解步骤控制在5分钟内完成。

（3）细菌的质量差（反复冻融的细菌，陈旧的细菌，培养条件不合适的细菌等）中有许多断裂或降解而游离的基因组DNA，使用生长良好的新鲜细菌。

超螺旋质粒比例低

如图右所示，质粒提取之后进行琼脂糖凝胶电泳，开环质粒的占比约20%，说明超螺旋比例低，一般超螺旋比例需要＞90%，一般来说超螺旋比例越高，质粒的稳定性越高，高超螺旋比例的质粒在转染效率、基因表达水平等方面具有更好的表现。

原因：裂解时间不宜过长，加入裂解液后裂解时间不应超过5分钟，以免质粒受到破坏

解决方法：优化裂解时间；确保质粒的结合和所有溶液都在室温下进行，减少离心力对质粒超螺旋结构的影响，因为过度的离心可能会破坏质粒的超螺旋结构。

内毒素残留高

常规质粒DNA纯化中，质粒DNA仍需要从55%蛋白质、20%RNA、3%内毒素和3%基因组DNA中分离，在质粒DNA制备的菌体裂解过程中，内毒素分子被释放到溶菌液中。由于内毒素常形成囊状结构，其分子量、电荷性和疏水性都与质粒DNA相似，常用的纯化方法很难将内毒素与质粒DNA分开。内毒素会降低原代细胞和敏感培养细胞的转染效率，干扰免疫细胞的体外转染。由于实验目的不同，对质粒DNA的内毒素要求亦不同，尤其是在细胞转染、基因沉默研究、基因治疗等过程中，对质粒质量、内毒素水平要求更为苛刻，对于非敏感型的的转染实验，要求内毒素残留0.1～2.5 EU/ug，对于敏感型的的转染实验，要求内毒素残留＜0.1 EU/ug。

原因：内毒素去除时操作不当或者未选择合适的试剂

解决方法：

（1）如果采用的内毒素清除的方法，离心之后，上层水相含DNA，下层蓝色油状相含内毒素和其它杂质。这时注意不要吸到蓝色油状层，里面含内毒素等杂质。

（2）在使用树脂纯化系统去除内毒素时，需要先活化树脂，然后使用平衡缓冲液平衡树脂，以确保最佳的去除效率。

翌圣生物的质粒提取试剂盒，历经市场多年的磨砺与锤炼，产品成熟而稳定。产品品质，不仅赢得了广泛的认可与赞誉，更累积了超过300的影响因子总分数，成为众多科研工作者的首选！

产品推荐

柱式法

货号	产品名称	规格
19021ES	MolPure^® Endo-free Plasmid Mini Kit 无内毒素质粒小量提取试剂盒	50T/200T
19001ES	MolPure^® Plasmid Mini Kit 质粒小量提取试剂盒	50T/200T
19036ES	MolPure^® Endo-free Plasmid Maxi Kit 无内毒素质粒大量提取试剂盒	10T
19101ES	MolPure^® Gel Extraction Kit 琼脂糖凝胶回收试剂盒	50T/200T
19106ES	MolPure^® PCR Purification Kit PCR产物纯化试剂盒	50T/200T

磁珠法

货号	产品名称	规格	备注
18538ES	MolPure® Magnetic Plasmid Mini Kit 磁珠法质粒小量提取	50 T/200 T	磁珠，瓶装
18539ES	MolPure® Mag16/48 Plasmid Mini Kit（Prepackaged）磁珠法16/48孔质粒小量提取试剂盒（预封装）	16 T/48T	磁珠16/48预装，适配AP-16S和AP-48
18541ES	MolPure® Mag96 Plasmid Mini Kit （Prepackaged）磁珠法96孔质粒小量提取试剂盒（预封装）	96T	磁珠96预装，适配AP-96N
18542ES	18542ES MolPure® Magnetic Endo-free Plasmid Mini Kit 磁珠法去内毒素质粒小量提取试剂盒	48 T	磁珠，瓶装
18543ES	18543ES MolPure® Magnetic Plasmid med Kit 磁珠法质粒去内毒素中量提取试剂盒	24T/48 T	磁珠，瓶装