Plvx-PGK质粒 | 80mL菌液质粒大提案例
13560
2026-01-19
实验所用试剂清单
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试剂 |
19037ES 无内毒素质粒大量提取试剂盒V2 |
转染试剂：40802ES |
无水乙醇 |
异丙醇 |
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耗材 |
50 mL离心管 |
2 mL细心管 |
50 mL离心管架 |
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设备 |
Thermo角转子离心机 |
移液器 |
琼脂糖凝胶电泳设备 |
Nanodrop |
操作步骤
菌体收集、裂解与澄清
1.菌体收集： 通过多次离心收集所需要的菌体量。
取80 mL菌液分装到2个50 mL离心管中，6000×g离心3 min，弃上清。
2.重悬菌体：加入10 mL溶液SI，振荡至无可见菌块。
3.裂解处理：加入10 mL溶液SII，轻柔翻转混匀4~10次，形成透明裂解液（裂解时间4 min）。
4.中和并澄清沉淀：加入8 mL溶液SIII，100 µL RNase A，翻转混匀10次，室温静置10 min，10000×g离心5 min。
5.使用推杆过滤器将上清液过滤至50 mL尖底离心管（得约25mL上清），加10 mL 结合液PB混匀备用。
质粒纯化
6.吸附柱平衡：（建议在处理上清液期间处理）向吸附柱E2加4 mL平衡液BS，静置2 min，6000×g离心2 min，弃废液。
7.吸附柱吸附质粒：步骤5所得混合液，通过多次离心，将样品吸附到吸附柱E2柱中。混合液用量9 mL/次，分4次离心，6000×g离心2 min。。
8.漂洗：加入8 mL溶液W1漂洗一次，8 mL漂洗液WS（漂洗两次），每次6000×g离心2 min
9.干燥：10000×g空离5 min，并室温放5 min彻底去除乙醇。
质粒洗脱
10. 加入1.2 mL洗脱缓冲液EB，室温静置5 min，10000×g离心3 min收集洗脱液。
细节注意
1.结合液的比列一定要准确，不能加少，可以略多加；
2.菌体一定要打散，如果成块裂解不完全，会影响质粒得率；
3.加入无水乙醇和异丙醇之后，一定要剧烈晃均匀。
质检结果
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样本 |
浓度（nanodrop） |
A260/A280 |
A260/A230 |
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1 |
700 ng/μL |
1.9 |
2.0 |
293T细胞转染
实验结论
3个pCMV质粒样本，从80 mL菌液中提取的质粒DNA浓度为700 ng/μL，该浓度符合转染实验要求。随后使用翌圣转染试剂（40802ES）将质粒转染至293T细胞，转染效率显著。
数据来源：上海某高校
