干货 | 蛋白表达第一弹-质粒提取

重组蛋白定义

利用重组DNA或RNA获得目的蛋自的技术，其原理是将外源基因与载体连接成重组载体，然后转入到宿主菌从而表达目的蛋白。

蛋白表达核心流程概览

基因克隆 → 载体构建 → 转化/转染 → 诱导表达 → 蛋白提取 → 纯化 → 鉴定

蛋白表达详细步骤

Step 1

基因克隆与载体构建

目的：将目标基因插入表达载体，获得重组质粒。
操作：
1)设计引物（含酶切位点或同源臂）
2)PCR扩增目的基因
3)双酶切或同源重组连接载体
4)转化大肠杆菌DH5α，涂板筛选
5)菌落PCR、酶切鉴定、测序验证

Step 2

宿主细胞转化/转染

体系	方法	要点
原核（大肠杆菌）	热激法转化	将重组质粒转入BL21(DE3)等表达菌株
真核（哺乳动物）	脂质体转染/电转	293T、CHO等细胞，需优化转染效率
酵母/昆虫细胞	电转或化学转化	特定宿主如毕赤酵母、Sf9细胞
植物	农杆菌介导、基因枪、病毒递送（TRV/TMV）	筛选标记包括抗生素抗性、除草剂抗性、荧光标记

Step 3

诱导表达

原核表达（IPTG诱导）
1)小试优化：设置IPTG浓度梯度（0.1-1 mM）、温度梯度（16-37℃）、时间梯度（2-16 h）
2)SDS-PAGE检测：确定最佳表达条件

真核表达
1)瞬时转染：质粒在细胞中暂时表达，48-72 h后收蛋白
2)稳定细胞系筛选：加抗生素（G418/嘌呤霉素）筛选2-4周
3)诱导型启动子：如Tet-On系统需添加诱导剂

方法	适用场景	裂解液配方
超声破碎	大肠杆菌（胞内蛋白）	50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF
匀浆法	哺乳动物细胞	含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂
酶解法	酵母细胞壁	溶菌酶+蜗牛酶处理
化学渗透	周质空间蛋白	渗透压冲击法

Step 4

细胞裂解与蛋白提取

⚠️ 关键：全程4℃操作，充分添加蛋白酶抑制剂（PMSF、Cocktail）

Step 5

蛋白纯化

蛋白纯化基于分子间相似性与差异，主要采用层析、沉淀及过滤技术。

纯化方法	具体技术	分离原理	特点与优势
层析法（核心方法）	离子交换层析	电荷差异（等电点）	载量高、分辨率高，适用于捕获初纯
	疏水作用层析	疏水性差异	在高盐环境下结合，有效去除杂蛋白
	亲和层析	特异性标签/配体捕获	选择性最强，一步纯化可达95%以上纯度
	凝胶过滤层析	分子大小（排阻效应）	分子筛分，精纯化并去除痕量杂质
沉淀法	盐析/有机溶剂沉淀	溶解度变化	成本低、处理量大，适合粗提和浓缩
膜分离技术	超滤/透析	分子量截留（孔径筛分）	浓缩样品、置换缓冲液，保护蛋白活性

策略建议：根据目的蛋白的稳定性、标签类型及理化性质，优先选择亲和层析快速捕获，再辅以离子交换或凝胶过滤精纯，沉淀法常用于初始浓缩。

Step 6

蛋白鉴定与质量控制

检测方法	优点	缺点
紫外吸收法（A280）	快速无损（<1分钟）、无需试剂、样品可回收、操作简便	易受核酸/缓冲液干扰、灵敏度低（需≥0.1 mg/mL）、无酪氨酸/色氨酸时不适用
Bradford法	快速（5分钟）、灵敏（μg级）、颜色稳定、兼容还原剂	蛋白间差异大、受去垢剂（SDS、Triton）抑制、标准曲线非线性
BCA法	灵敏稳定、线性范围广、耐受大部分去垢剂、兼容性强	耗时（需30-60分钟孵育）、受还原剂（DTT、β-ME）干扰、需精确控温
Lowry法	灵敏度较高（较Bradford略高）	操作繁琐、试剂不稳定、易受多种物质干扰、重现性差、已较少使用
荧光法	灵敏度极高（ng级）、样品用量少、动态范围宽、特异性强	需荧光检测仪、试剂成本高、易受背景荧光干扰、需优化染料浓度

选择建议：纯化蛋白首选A280快速检测；粗提液或含去垢剂样品推荐BCA法；高通量筛选用Bradford法；微量样品选荧光法。

常见问题与解决方案

问题	原因	解决方案
无表达	密码子偏好性、启动子问题	更换表达菌株（Rosetta）、优化诱导条件
包涵体	蛋白折叠错误	降低诱导温度（16℃）、添加分子伴侣
降解	蛋白酶降解	添加蛋白酶抑制剂、快速操作
内毒素高	革兰氏阴性菌裂解	使用去内毒素试剂盒、更换真核系统

质粒：蛋白表达的"总设计师"

质粒作为携带目的基因的表达载体，其设计直接决定了蛋白表达的成败。强启动子（如T7/lac）驱动转录效率、抗性基因保障筛选稳定性、亲和标签（His/GST）简化后续纯化、密码子优化提升翻译水平——这些元件的精密组合，构成了蛋白表达的"蓝图"。一个优质的质粒，既要具备高拷贝数以获得基因剂量优势，又要保证复制稳定性避免宿主负担过重。

质粒提取：被低估的"第一战役"

质粒提取绝非简单的"提DNA"操作，而是整个蛋白表达流程中承上启下的关键环节。提取产物的质量直接决定了下游实验的成败：纯度不足（残留内毒素、RNA或基因组DNA）会抑制宿主细胞生长甚至导致表达沉默；浓度不够则影响转染效率；而质粒降解更是断送了所有后续努力。许多研究者遭遇的"转化失败""表达量低""蛋白无活性"等问题，根源往往回溯到这第一步操作。可以说，质粒提取的质量，为整个蛋白表达项目定下了基调。

翌圣生物：从源头护航蛋白表达

针对这一关键环节，翌圣生物提供从质粒提取到蛋白表达的全流程优化方案。其质粒小提/中提/大提系列试剂盒采用改良的裂解-中和-纯化技术，内毒素残留低于0.1 EU/μg，A260/A280比值稳定在1.8-2.0之间，确保质粒的高纯度与完整性。我们拥有蛋白制备研究的整体解决方案，包括载体构建、蛋白表达、蛋白纯化、蛋白分析，为您的研究保驾护航。

柱式质粒提取选择指南

产品名称	产品货号	产品特点
质粒小量提取	19001ES	菌液兼容量1-5 mL；得率高、纯度好
无内毒素质粒小量提取	19021ES	菌液兼容量1-5 mL，内毒素≤1 EU/μg；
无内毒素质粒小中量快速提取	19022ES	菌液兼容量5-15 mL，内毒素≤1 EU/μg；
无内毒素质粒中量快速提取	19023ES	菌液兼容量30-70 mL，内毒素≤1 EU/μg；
无内毒素质粒大量提取	19037ES	菌液兼容量200 mL，内毒素≤1 EU/μg；
超纯无内毒素质粒大量提取	19038ES	菌液兼容量200 mL，内毒素≤0.01EU/μg；

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