Hieff NGS® MagSP rRNA Removal Kit (Mammal) with purification beads

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产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

 

Hieff NGS® MagSP rRNA Removal Kit (Mammal) with purification beads是利用链霉亲和素标记的磁珠去除哺乳动物来源总RNA中的核糖体RNA以保留信使RNA(mRNA)和其他非编码RNA。该试剂盒对于完整和部分降解的总RNA均具有良好的rRNA去除效果。经rRNA去除所获得的RNA样本可用于高通量测序分析的mRNA和非编码RNA,可显著提高测序结果中有效数据比例,也可用于cDNA合成及其它下游应用。

 

适用范围

适用于哺乳动物来源的10 ng~1 μg 总RNA样品。

 

产品组分

组分编号和名称

12266ES04

12266ES24

12266ES96

BOX I

12266-A

PM, Probe Mix

13.5 μL

80 μL

317 μL

BOX II

12266-B

HB, Hybridization buffer

25 μL

150 μL

600 μL

12266-C

DB, Depletion buffer

800 μL

4.6 mL

18.5 mL

12266-D

SMB, Streptavidin-coated magnetic beads

176 μL

1056 μL

4.23 mL

12266-E

PB, Purification beads

795 μL

4.75 mL

19 mL

 

储存条件

试剂盒BOXI(Probe Mix)-25~-15℃保存,BOXII2~8℃保存,有效期1年。

 

注意事项

1. 请使用无RNase污染的耗材,并对实验区域定期进行清理,推荐使用Thermo Fisher公司的RNAZapTM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。

2. RNA样品应不含基因组DNA污染,若样品中有gDNA残留,应先进行DNase I消化并纯化后再用于本试剂盒。

3. 使用前,磁珠需提前平衡至室温。

4. RNA投入量为10 ng- 1000 ng。

5. 在操作过程种,避免EP管或PCR管管盖开封(孵育过程中)或长时间处于室温状态。

6.为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

7.本产品仅用作科研用途!

 

自备材料

1. qRT-PCR质检rRNA去除效率:Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox)(Cat#11201)或其他等效产品;

2. 其他材料: 无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

 

操作步骤

1. 探针杂交

1.1 将探针、Streptavidin-coated magnetic beads和杂交Buffer从-20°C 取出,解冻后颠倒混匀,探针置于冰上放置,其余试剂平衡至室温备用。

1.2 准备RNA样品:根据投入量和样品浓度,计算RNA取样体积,用Nuclease free H2O稀释至12 μL。

1.3 按照表1于200 μL PCR管中配制rRNA去除反应体系。

1 探针杂交反应体系

名称

体积(μL)

Hybridization Buffer

5

Probe Mix

3

Total RNA

12(10 ng~1 μg)

Total

20

1.4 使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。

1.5 将上述 PCR 管置于PCR仪中,按照表2所示反应程序,进行探针杂交反应。

2 探针杂交反应程序

温度

时间

热盖105°C

On

68℃

10 min

68℃-37℃

0.1℃/s

37℃*

2 min

*注:采用梯度退火之后,需要尽快进入下一操作步骤,严禁PCR程序中出现4℃ hold,否则会影响去除效果。
2. 链酶亲和素磁珠准备

2.1低速涡旋振荡链酶亲和素磁珠使磁珠重悬。

2.2 使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。

2.3 吸取40 μL Streptavidin-coated magnetic beads于新的PCR管中,将PCR管置于磁力架上,静置2 min;。

2.4待溶液澄清后,去掉所有上清液。

2.5向PCR管中加入80 μL Depletion buffer后,用移液器吹打10次混匀。

2.6将PCR管置于磁力架上,静置2 min,待溶液澄清后,去上清。

2.7向PCR管中加入80 μL Depletion buffer后,用移液器吹打10次混匀。

3. rRNA去除

3.1瞬离将步骤1中杂交样品离心至管底。

3.2 将步骤2中的链酶亲和素磁珠加入步骤1的样品中,用移液器吹打10次混匀后,置于PCR仪中,按照表3所示反应程序,进行探针捕获。

3 rRNA去除反应程序

温度

时间

热盖105°C

On

37℃

15 min

50℃

5 min

*立即进入下一步骤

*注:去除反应程序完成后,需要尽快进入下一操作步骤,严禁PCR程序中出现4℃ hold,否则会影响去除效果。
3.3 瞬离将反应液离心至管底

3.4 将样品管置于磁力架上,静置2 min。

3.5 待溶液澄清后,小心转移上清至新的PCR管中。

3.6 将PCR管置于磁力架上,静置2 min,待溶液澄清后,小心转移上清至新的PCR管中(建议)。

4. RNA纯化

4.1 准备工作:将Purification beads由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。用Nuclease free H2O配制 80%乙醇。

4.2 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

4.3 吸取 180 μL Purification beads至上一步产物中,移液器充分吹打混匀,室温孵育 5 min。

4.4 将PCR管置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约3 min),小心移除上清。

4.5 保持PCR管始终置于磁力架中,加入 200 μL Nuclease free H2O新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育 30 sec 后,小心移除上清。

4.6 重复步骤 4.5,总计漂洗两次。用 10 μL移液器吸干净残留液体。

4.7 保持 PCR 管始终置于磁力架中,室温下开盖干燥磁珠(5~10 min)。

4.8 RNA洗脱:将PCR 管从磁力架上取下,加入 11 μL Nuclease free H2O(或使用适合下游实验的相应体积Nuclease free H2O或洗脱缓冲液),使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置 5 min。

4.9 将 PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约3 min),小心移取 10 μL上清(可根据步骤4.8选择的实际洗脱体积进行相应调整)至新的Nuclease free PCR 管中。

【注】洗脱后的样品请立即进行下游实验,或置于-80℃存放。

Ver.CN20230316

400-6111-883