cfRNA简介、研究方法和应用
cfRNA简介、研究方法和应用
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2026-10-12
液体活检技术凭借无创、可重复、可实时动态监测疾病进展、规避肿瘤空间异质性等优势，已成为精准医学领域的研究热点，相较于传统组织活检，其在疾病早期筛查、疗效评估、预后预测及复发监测中展现出不可替代的应用价值。循环游离核酸是液体活检的核心检测对象，主要包括细胞游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）与循环游离RNA（cell-free RNA, cfRNA）两类。其中，cfDNA序列信息相对稳定，但表达动态性差、组织溯源特异性有限；而cfRNA来源于细胞转录过程，能够实时反映机体细胞的生理、病理状态，且具有严格的组织与时空特异性，可精准捕捉机体微小的分子水平病变。
cfRNA广泛存在于血浆、血清、尿液、胸腔积液、肺泡灌洗液等人体体液中，主要由细胞凋亡、坏死、主动分泌及细胞外囊泡释放产生，可稳定存在于体液中，规避了游离RNA易被核酸酶降解的问题。相较于传统生物标志物，cfRNA含量变化早于机体影像学及临床症状改变，是疾病早期诊断的理想靶点。目前，cfRNA相关技术已逐步从基础科研走向临床应用，在多系统疾病的精准诊疗中展现出巨大潜力。
cfRNA是指因生理或病理事件（如细胞凋亡、坏死、自噬或主动分泌）从各种细胞类型释放或分选进入生物体液的RNA分子混合物，可在血浆、血清、尿液、脑脊液及唾液等样本中循环存在。与细胞内RNA不同，cfRNA通常处于高度片段化状态，这是因为循环环境中普遍存在RNase等核糖核酸酶，可迅速降解裸露的RNA分子。然而，部分短片段甚至长片段RNA可通过蛋白质结合、局部RNA二级结构形成或包裹于细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）中而免于完全降解。
cfRNA的释放机制主要包括
被动释放：细胞凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）过程中，细胞内RNA被动泄漏至胞外空间
细胞通过微囊泡（microvesicles）脱落或外泌体（exosomes）信号途径主动释放RNA，参与细胞间通讯
cfRNA是一个高度异质性的RNA群体，涵盖多种RNA生物型（biotypes）。根据exoRBase 3.0等数据库的系统性注释，cfRNA主要包括以下几类，这些RNA分子在体液中以两种主要形式存在
[ 1 ] 与蛋白质（如Ago2、脂蛋白、核糖核蛋白）结合形成循环核糖核蛋白复合物
[ 2 ] 包裹于外泌体或其他细胞外囊泡中，受到脂质双分子层保护，稳定性显著增强
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RNA类型 |
英文全称 |
主要特征与功能 |
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mRNA |
messenger RNA |
蛋白质编码基因的转录本片段，可反映组织特异性基因表达状态 |
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miRNA |
microRNA |
长度约18–25 nt的小非编码RNA，通过调控靶基因表达参与多种病理生理过程 |
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lncRNA |
long non-coding RNA |
长度>200 nt的非编码RNA，参与染色质修饰、转录调控等 |
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circRNA |
circular RNA |
环状闭合结构，稳定性较高，可作为miRNA海绵调控基因表达 |
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tRNA |
transfer RNA |
传统翻译相关分子，其片段（tRFs/tiRNAs）在应激反应中发挥信号功能 |
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rRNA |
ribosomal RNA |
核糖体RNA片段，在血浆中含量丰富但功能研究较少 |
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piRNA |
PIWI-interacting RNA |
主要与生殖系和转座子沉默相关，在体液中也有检出 |
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snRNA/snoRNA |
small nuclear/nucleolar RNA |
剪接体及核糖体生物发生相关小RNA |
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YRNA |
Y RNA |
与Ro核糖核蛋白复合物相关，在应激和细胞死亡时释放 |
cfRNA的检测流程通常包括样本采集与前处理、RNA提取、文库制备/分子检测、数据分析五个环节。由于血浆中cfRNA浓度极低（健康人约7.1 ng/mL，癌症患者约7.9 ng/mL），且高度片段化，每个环节的技术选择均直接影响下游结果的灵敏度与可靠性。
[ 1 ] 抗凝剂选择：EDTA是cfRNA研究的首选抗凝剂，因其可螯合Mg²⁺、Ca²⁺等二价阳离子，抑制RNase活性。肝素（heparin）应严格避免，因其会强烈抑制逆转录酶和PCR酶活性，严重干扰下游分析。
[ 2 ] 血浆分离：推荐采用两步离心法：首次以约1,600×g离心分离血浆，第二次以约16,000×g离心去除残留细胞及碎片，最大限度降低细胞裂解导致的基因组DNA和细胞内RNA污染。
[ 3 ] 溶血控制：溶血会释放大量红细胞内RNA，严重干扰cfRNA谱。血浆血红蛋白浓度应控制在50 g/L以下，可通过414 nm吸光度检测评估溶血程度。
[ 4 ] 储存条件：血浆应在采血后4小时内分离，分装后于−80°C保存，避免反复冻融，以维持RNA完整性。
[ 1 ]酚/氯仿有机溶剂法：基于酚-异硫氰酸胍裂解和液相分离原理，可提取不同长度的RNA分子。改良的TRIzol冷冻沉淀法（TFP）通过添加糖原和异丙醇并在−80°C沉淀，可显著提高30–60 nt超短非编码RNA的回收率。
[ 2 ]硅胶膜柱法：利用离液盐条件下RNA与硅胶膜的结合特性进行纯化，可覆盖18–200 nt的RNA片段，兼容RT-qPCR及小RNA测序。不同品牌试剂盒存在显著的提取偏向性：部分试剂盒对长RNA回收效率高，而对某些常见mRNA的检测存在困难；此外，多数cfRNA提取试剂盒会共提取cfDNA，需在提取前或提取后加入DNase处理步骤以减少DNA污染。
[ 3 ]磁珠法与自动化提取：磁珠法通过表面修饰的顺磁珠捕获裂解后的RNA，易于实现自动化。
[ 4 ]外泌体富集策略：若研究目标为囊泡相关cfRNA，可在提取前采用沉淀法、膜亲和柱法、尺寸排阻色谱（SEC）或差速超速离心法富集EVs。不同方法在纯度、得率和操作复杂度之间存在权衡：沉淀法简单快速但易共沉淀非EV蛋白；超速离心法无需化学试剂但RNA得率较低；膜亲和柱法可在约1小时内完成，但会丢失非囊泡性RNP结合RNA（如Ago2-miRNA复合物）。
cfRNA的下游检测技术需根据研究目的、RNA类型及样本量进行选择。
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检测技术 |
原理与特点 |
优势 |
局限性 |
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RT-qPCR |
逆转录结合实时荧光定量PCR |
灵敏度高、定量准确、成本适中 |
仅适用于已知序列，需预先设计引物探针 |
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ddPCR |
微滴数字PCR，绝对定量 |
无需标准曲线，极低拷贝数RNA检测精度高，适合稀有事件分析 |
通量较低，成本较高 |
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NGS（RNA-seq） |
高通量测序 |
全面检测已知和未知序列，可发现新标志物，提供转录组信息 |
成本高，数据分析复杂，对低丰度小RNA检测存在偏向 |
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PALM-Seq |
多聚腺苷酸化连接介导测序 |
可定量转录本、发现新转录本及可变剪接事件 |
对RNA质量要求高，无法提供绝对表达水平 |
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LIME-seq |
低投入多重甲基化测序 |
捕获RNA修饰诱导的错配信号，实现表观转录组分析 |
流程复杂，需专用生物信息学分析 |
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质谱 |
检测RNA修饰 |
可提供详细RNA修饰及结构信息 |
仪器要求高，应用范围有限 |
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流式细胞术 |
荧光标记探针结合流式检测 |
可快速定量特定cfRNA，结合抗体分析细胞亚群 |
在复杂RNA表达分析中应用受限 |
cfRNA在肿瘤液体活检中的应用是近年来发展最快的领域，涵盖早期筛查、疗效监测、耐药追踪及微小残留病灶（MRD）检测。如：多癌种早期检测、治疗反应与预后评估、耐药机制监测、结直肠癌与消化系统肿瘤。
产前诊断与妊娠监测：cfRNA在产科的应用历史可追溯至2000年，Lo等人首次在妊娠男性胎儿孕妇血浆中检测到Y染色体RNA。此后，cfRNA被广泛应用于非侵入性产前检测（NIPT）及妊娠并发症预测。如：妊娠进展监测、子痫前期早期预测、早产风险预测。
在实体器官移植领域，cfRNA可用于无创评估移植器官状态。供体来源的cfRNA（dd-cfRNA）可在受者血浆中被特异性检测，反映移植器官的细胞损伤、排斥反应或感染事件。与cfDNA联合分析时，cfRNA可提供关于基因表达活性的补充信息，帮助区分缺血再灌注损伤与急性排斥反应。
cfRNA在肥胖及相关代谢中的应用日益受到关注。研究表明，肥胖患者cfDNA水平升高反映脂肪组织扩张过程中脂肪细胞加速更新；而cfRNA则提供了关于脂肪组织胰岛素抵抗、炎症状态及非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）、2型糖尿病等并发症的转录组信息。此外，cfRNA在感染性疾病（如脓毒症）、自身免疫性疾病及心血管疾病的诊断和预后评估中也展现出潜力，能够反映病变组织的特异性基因表达变化及系统性炎症状态。
尽管cfRNA研究取得了显著进展，但其临床转化仍面临多重挑战：
目前cfRNA提取试剂盒之间存在显著的回收偏向性，不同方法对长RNA、miRNA及超短RNA的富集效率差异巨大，导致跨实验室数据整合困难。建立统一的前处理、提取及检测标准迫在眉睫
cfRNA的高度片段化对序列比对、定量及功能注释提出了特殊挑战。需要开发专门针对cfRNA的比对算法、降解模式校正模型及修饰识别流程，以充分挖掘NGS数据的生物学意义
血浆中存在大量由造血细胞释放的"健康背景"RNA，寻找肿瘤或病变组织特异性的低丰度cfRNA信号如同"大海捞针"。暗通道生物标志物、组织特异性表达印记及表观转录组修饰等策略有望提高信噪比
大多数cfRNA标志物仍处于研究阶段，缺乏大规模前瞻性队列验证。未来需要开展多中心、多样本的临床试验，建立标准化的检测流程和质量控制体系，推动cfRNA检测通过监管审批并纳入临床指南
翌圣生物作为NGS领域的核心酶原料供应商，凭借六大核心技术平台（双向分子酶理性设计与定向进化平台、蛋白高密度发酵与超洁净纯化平台、分子诊断试剂关键原料研发平台等）与多年行业积累经验，构建了覆盖核酸提取、文库构建、文库定量等全系列产品矩阵，助力科研人员高效开展cfRNA NGS技术的相关研究。
【产品选择指南】
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产品类别 |
产品名称 |
货号 |
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核酸提取 |
MolPure® Cell/Tissue miRNA Kit 细胞/组织miRNA提取试剂盒 |
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MolPure® Serum/Plasma miRNA Kit 血清/血浆miRNA提取试剂盒 |
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Small RNA建库试剂盒 |
Hieff NGS® Small RNA Library Prep Kit for Illumina/Small RNA建库试剂盒 |
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建库接头引物 |
Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina®（Illumina双端唯一接头，板式接头） |
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Hieff NGS® Dual UMI UDI Adapter Kit for Illumina® （96种双端唯一index的Illumina平台UMI接头，Set1） |
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Hieff NGS® Dual UMI UDI Adapter Kit for Illumina ®, Set2（96种双端唯一index的Illumina平台UMI接头，Set2） |
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Hieff NGS® Dual UMI UDB Adapter Kit for MGI®, Set1（96种双端唯一短接头Barcode，MGI平台UMI接头，Set1） |
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Hieff NGS® Dual UMI UDB Adapter Kit for MGI®, Set2（96种双端唯一短接头Barcode，MGI平台UMI接头，Set2） |
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文库定量 |
1× dsDNA HS Assay Kit |
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DNA纯化与分选磁珠 |
Hieff NGS® DNA selection Beads (Superior Ampure XP alternative)DNA纯化分选磁珠 |
