Hieff NGS^® MaxUp rRNA Depletion Kit (Plant)利用RNase H消化法去除植物来源总RNA中的核糖体RNA（包括细胞质18S、25S rRNA，线粒体18S、26S rRNA，叶绿体16S、23S rRNA）以保留信使RNA (mRNA)和其它非编码RNA。该试剂盒对于完整和部分降解的总RNA均具有良好的rRNA去除效果。经rRNA去除所获得的RNA样本可用于高通量测序分析mRNA和非编码RNA，可显著提高测序结果中有效数据比例，也可用于cDNA合成或其它下游应用。

 

适用范围

适用于多种植物来源的100 ng~1 μg 总RNA样品；适用于完整或部分降解RNA样品。

 

产品组分

 

运输与保存方法

干冰运输，-20 °C存放。效期一年。

 

注意事项

1. 请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用Thermo Fisher公司的RNAZap^TM 高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。

2. RNA样品应不含基因组DNA污染，若样品中有gDNA残留，应先进行DNase I消化并纯化后再用于本试剂盒。

3. RNA样品最大投入体积为10 μL，若样品体积较大，可先进行浓缩。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5. 本产品仅作科研用途！

 

自备材料

1. RNA纯化磁珠：Hieff NGS^® Cleaner (Cat#12602)或其他等效产品。

2. qRT-PCR质检rRNA去除效率：Hieff^® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) (Cat#11201)或其他等效产品。

3. 其他材料： 无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

 

操作步骤

1. 探针杂交

1.1 将探针和杂交Buffer从-20 °C 取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

1.2 准备RNA样品：根据投入量和样品浓度，计算RNA取样体积，用Nuclease free H₂O稀释至11 μL。

1.3 按照表1于200 μL PCR管中配制rRNA去除反应体系。

表1 探针杂交反应体系

名称	体积 (μL)
Hybridization Buffer	3
Probe Mix (Plant)	3
Total RNA	9（100 ng~1 μg）
Total	15

1.4 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

1.5 将上述 PCR 管置于PCR仪中，按照表2所示反应程序，进行探针杂交反应。

表2 探针杂交反应程序

温度	时间
热盖105°C	On
95 °C	2 min
95 °C-22 °C	0.1 °C/s
22 °C	5 min
4 °C	Hold

2. RNase H消化

2.1将RNase H消化试剂从-20 °C取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。按照表3所示，配制RNase H消化反应体系。

表3 RNase H消化反应体系

名称	体积 (μL)
RNase H Buffer	3
RNase H	2
上步产物	15
Total	20

2.2 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

2.3 将上述 PCR 管置于PCR仪中，设置反应程序：热盖50°C，37 °C，30 min； 4°C，hold，进行RNase H消化反应。

3. DNase I 消化

3.1将DNase I消化试剂从-20 °C 取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。按照表4所示，配制DNase I消化反应体系。

表4 DNase I消化反应体系

名称	体积 (μL)
DNase I Buffer	27.5
DNase I	2.5
上一步产物	20
Total	50

3.2 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

3.3 将上述 PCR 管置于PCR仪中，设置反应程序：热盖50 °C，37 °C，30 min；4 °C，hold，进行DNase I消化反应。

4. RNA纯化

4.1 准备工作：将 Hieff NGS^® RNA Cleaner (Cat#12602)磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少 30 min。用Nuclease free H₂O配制80%乙醇。

4.2 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

4.3 吸取110 μL Hieff NGS^® RNA Cleaner (2.2×，Beads:DNA=2.2:1)至上一步产物中，移液器充分吹打混匀，室温孵育 5 min。

4.4 将PCR管置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。

4.5 保持PCR管始终置于磁力架中，加入 200 μL Nuclease free H₂O新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec 后，小心移除上清。

4.6 重复步骤 4.5，总计漂洗两次。用 10 μL移液器吸干净残留液体。

4.7 保持 PCR 管始终置于磁力架中，室温下开盖干燥磁珠 (5~10 min)。

4.8 RNA洗脱：将PCR 管从磁力架上取下，加入 11 μL Nuclease free H₂O（或使用适合下游实验的相应体积Nuclease free H₂O或洗脱缓冲液），使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置 5 min。

4.9 将 PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取 10 μL 上清（可根据步骤4.7选择的实际洗脱体积进行相应调整）至新的Nuclease free PCR 管中。

【注】：洗脱后的样品请立即进行下游实验，或置于-80 °C存放。

 

案例展示

1）15种不同的植物样本，投入1μg进行RNA建库测试，rRNA的残留率如图1所示，rRNA残留率都在2%以内。

图1 不同类型植物样本，rRNA的残留率检测。

2）不同客户返样的植物样本，投入1μg进行RNA建库测试，rRNA的残留率如图2所示，rRNA残留率都在2%以内。

图2 不同客户返样植物样本，rRNA的残留率检测。

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