Hieff NGS® MagSP rRNA Removal Kit (Prokaryote) with purification beads是利用链霉亲和素标记的磁珠去除原核生物（细菌和古生菌通用）来源总RNA中的核糖体RNA以保留信使RNA（mRNA）和其他非编码RNA。该试剂盒对于完整和部分降解的总RNA均具有良好的rRNA去除效果。经rRNA去除所获得的RNA样本可用于高通量测序分析的mRNA和非编码RNA，可显著提高测序结果中有效数据比例，也可用于cDNA合成及其它下游应用。

 

适用范围

适用于原核生物（细菌和古生菌通用）来源的10 ng~1 μg 总RNA样品（若实验时去除单一物种rRNA，总RNA量不能超过200 ng，推荐使用100-200 ng）。

 

产品组分

组分编号和名称			12265ES04	12265ES24	12265ES96
BOX I	12265-A	PM, Probe Mix	13.5 μL	80 μL	317 μL
BOX II	12265-B	HB, Hybridization buffer	25 μL	150 μL	600 μL
	12265-C	DB, Depletion buffer	800 μL	4.6 mL	18.5 mL
	12265-D	SMB, Streptavidin-coated magnetic beads	176 μL	1056 μL	4.23 mL
	12265-E	PB, Purification beads	795 μL	4.75 mL	19 mL

 

储存条件

试剂盒BOXI（Probe Mix）-25~-15℃保存，BOXII2~8℃保存，有效期1年。

 

注意事项

1. 请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用Thermo Fisher公司的RNAZap^TM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。

2. RNA样品应不含基因组DNA污染，若样品中有gDNA残留，应先进行DNase I消化并纯化后再用于本试剂盒。

3. 使用前，磁珠需提前平衡至室温。

4. RNA投入量为10 ng- 1000 ng，但当实验时去除单一物种rRNA，总RNA量不能超过200 ng，推荐使用100-200 ng。

5. 在操作过程种，避免EP管或PCR管管盖开封（孵育过程中）或长时间处于室温状态。

6.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

7.本产品仅用作科研用途！

 

自备材料

1. qRT-PCR质检rRNA去除效率：Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox)（Cat#11201）或其他等效产品；

2. 其他材料： 无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

 

操作步骤

1. 探针杂交

1.1 将探针、Streptavidin-coated magnetic beads和杂交Buffer从-20°C 取出，解冻后颠倒混匀，探针置于冰上放置，其余试剂平衡至室温备用。

1.2 准备RNA样品：根据投入量和样品浓度，计算RNA取样体积，用Nuclease free H₂O稀释至12 μL。

1.3 按照表1于200 μL PCR管中配制rRNA去除反应体系。

表 1 探针杂交反应体系

名称	体积（μL）
Hybridization Buffer	5
Probe Mix	3
Total RNA*	12（10 ng~1 μg）
Total	20

*注：若为单一物种，Total RNA总量不能超过200 ng，推荐使用100-200 ng。
1.4 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

1.5 将上述 PCR 管置于PCR仪中，按照表2所示反应程序，进行探针杂交反应。

表 2 探针杂交反应程序

温度	时间
热盖105°C	On
68℃	10 min
68℃-37℃	0.1℃/s
37℃*	2 min

*注：采用梯度退火之后，需要尽快进入下一操作步骤，严禁PCR程序中出现4℃ hold，否则会影响去除效果。
2. 链酶亲和素磁珠准备

2.1低速涡旋振荡链酶亲和素磁珠使磁珠重悬。

2.2 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

2.3 吸取40 μL Streptavidin-coated magnetic beads于新的PCR管中，将PCR管置于磁力架上，静置2 min；。

2.4待溶液澄清后，去掉所有上清液。

2.5向PCR管中加入80 μL Depletion buffer后，用移液器吹打10次混匀。

2.6将PCR管置于磁力架上，静置2 min，待溶液澄清后，去上清。

2.7向PCR管中加入80 μL Depletion buffer后，用移液器吹打10次混匀。

3. rRNA去除

3.1瞬离将步骤1中杂交样品离心至管底。

3.2 将步骤2中的链酶亲和素磁珠加入步骤1的样品中，用移液器吹打10次混匀后，置于PCR仪中，按照表3所示反应程序，进行探针捕获。

表3 rRNA去除反应程序

温度	时间
热盖105°C	On
37℃	15 min
50℃	5 min
*立即进入下一步骤

*注：去除反应程序完成后，需要尽快进入下一操作步骤，严禁PCR程序中出现4℃ hold，否则会影响去除效果。
3.3 瞬离将反应液离心至管底。

3.4 将样品管置于磁力架上，静置2 min。

3.5 待溶液澄清后，小心转移上清至新的PCR管中。

3.6 将PCR管置于磁力架上，静置2 min，待溶液澄清后，小心转移上清至新的PCR管中（建议）。

4. RNA纯化

4.1 准备工作：将Purification beads由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。用Nuclease free H₂O配制 80%乙醇。

4.2 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

4.3 吸取 180 μL Purification beads至上一步产物中，移液器充分吹打混匀，室温孵育 5 min。

4.4 将PCR管置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。

4.5 保持PCR管始终置于磁力架中，加入 200 μL Nuclease free H₂O新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec 后，小心移除上清。

4.6 重复步骤 4.5，总计漂洗两次。用 10 μL移液器吸干净残留液体。

4.7 保持 PCR 管始终置于磁力架中，室温下开盖干燥磁珠（5~10 min）。

4.8 RNA洗脱：将PCR 管从磁力架上取下，加入 11 μL Nuclease free H₂O（或使用适合下游实验的相应体积Nuclease free H₂O或洗脱缓冲液），使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置 5 min。

4.9 将 PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取 10 μL上清（可根据步骤4.8选择的实际洗脱体积进行相应调整）至新的Nuclease free PCR 管中。

【注】洗脱后的样品请立即进行下游实验，或置于-80℃存放。

Ver.CN20230316