血液样本来源的mRNA中珠蛋白mRNA约占30%-70%，占据了大量的RNA测序数据，因此血液样本RNA建库过程中珠蛋白mRNA的去除是提高测序数据信息量的有效方法。Hieff NGS^® One-Step Globin mRNA Removal Kit (Cat#12260)利用靶向技术在cDNA合成过程中高特异性地抑制总RNA中的珠蛋白mRNA的逆转录，而不影响其他mRNA、非编码RNA以及环状RNA等非靶RNA的cDNA合成，从而在一链cDNA合成过程中高特异性去除珠蛋白mRNA。本产品结合翌圣生物的Hieff NGS^® One-Step rRNA Removal Kit (Cat#12258/12259)，可以对人类血液样本来源RNA中的rRNA和珠蛋白mRNA进行快速靶向去除。这种靶向去除技术相较于传统的RNase H消化法具有耗时短 (4 min)、操作简单（一步操作）和非靶RNA保留完整等优点，极大简化了操作流程和提高了建库效率，可以与市面上各类一链cDNA合成试剂配套使用。该试剂盒对于完整和部分降解的总RNA均具有良好的珠蛋白mRNA去除效果。经珠蛋白mRNA去除所获得的cDNA样本可用于高通量测序分析mRNA和非编码RNA，可显著提高测序结果中有效数据比例，也可用于其它cDNA下游应用。提供的试剂已经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了珠蛋白mRNA去除的稳定性和重复性。

 

适用范围

适用于全血RNA来源的1 ng-1 μg的总RNA样品。

 

产品组分

产品组份	12260ES08	12260ES24	12260ES96
One-Step Globin mRNA Removal Mix	8 μL	24 μL	96 μL

 

运输与保存方法

干冰运输，-20°C存放。效期两年。

 

注意事项

一、关于操作

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用Thermo Fisher公司的RNAZap^TM 高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。

3. RNA样品应不含基因组DNA污染，若样品中有gDNA残留，应先进行DNase I消化并纯化后再用于本试剂盒。

4. 若样品体积较大，可先进行浓缩。

5. 本产品仅用作科研用途！

二、自备材料

1. qRT-PCR质检珠蛋白mRNA去除效率：Hieff^® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) (Cat#11201)或其他等效产品。

2. 其他材料：无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、PCR仪等。

 

使用方法

一、操作流程
 

图1.使用快速去除rRNA (Cat#12258)及Globin mRNA (Cat#12260)试剂盒、RNA建库试剂盒进行RNA建库流程

 

二、操作步骤方案

方案1 :在逆转录体系中去除rRNA和Globin mRNA。

使用翌圣生物的Hifair^® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat#11119)进行本试剂盒rRNA去除效率测试。

1. 逆转录反应体系按下表进行（20 μL体系）：

RNA非片段化体系*			RNA片段化体系**
在PCR管中加入以下组份：			在PCR管中加入以下组份：
Total RNA	1 ng-1 μg		Total RNA	1 ng-1 μg
Random Primers N6 (50 μM)	1 μL		Random Primers N6 (50 μM)	1 μL
One-Step rRNA Removal Mix (Cat#12258/12259)	1 μL		One-Step rRNA Removal Mix (Cat#12258/12259)	1 μL
One-Step Globin mRNA Removal Mix (Cat#12260)	1 μL		One-Step Globin mRNA Removal Mix (Cat#12260)	1 μL
			5×Hifair® Ⅱ Buffer	4 μL
RNase free H2O	To 14 μL		RNase free H2O	To 18 μL
混匀后瞬离，按照下列反应程序进行反应：			混匀后瞬离，按照下列反应程序进行反应：
			94°C（片段化温度和时间可根据需求自行调整）	7 min
75°C	1 min		75°C	1 min
65°C	1 min		65°C	1 min
50°C	2 min		50°C	2 min
4°C	Hold		4°C	Hold
在PCR管中加入以下组份：			在PCR管中加入以下组份：
上述反应体系	14 μL		上述反应体系	18 μL
5×Hifair® Ⅱ Buffer	4 μL
Hifair® Ⅱ Enzyme Mix	2 μL		Hifair® Ⅱ Enzyme Mix	2 μL
Total	20 μL		Total	20 μL
混匀后瞬离，按照下列反应程序进行反应：			混匀后瞬离，按照下列反应程序进行反应：
25°C	5 min		25°C	5 min
42°C	30 min		42°C	15 min
85°C	5 min		85°C	5 min

【注】：*：RNA非片段化体系主要是为了保证RNA的完整性，主要应用于cDNA库的制备、RT-qPCR，低浓度RNA建库和三代测序建库等领域。

**：RNA片段化体系主要是为了保证RNA在建库过程中的有效片段化，主要应用于RNA二代测序。客户可根据实验需求自行选择。

 

2. qPCR检测rRNA及Globin mRNA去除效果。

 

 

 

图2.qPCR验证rRNA及Globin mRNA一步法去除试剂盒的去除效果。 DEPC H₂O：未添加去除rRNA和Globin mRNA的探针进行qPCR；Cat#12258+12260：在反应体系中同时使用本公司试剂盒Cat#12258+Cat#12260的探针去除rRNA和Globin mRNA后进行qPCR。

 

方案2：在RNA NGS文库构建中去除rRNA和Globin mRNA。

1. 使用翌圣生物的Hieff NGS^® Dual-mode RNA Library Prep Kit (Cat#12252 for Illumina, Cat#13332 for MGI)进行本试剂盒rRNA和Globin mRNA去除效率测试：

 

组分	体积
Total RNA	1 ng-1 μg
2×Frag/Prime Buffer	8.5 μL
One-Step rRNA Removal Mix (Cat#12258)	1 μL
One-Step Globin mRNA Removal Mix (Cat#12260)	1 μL
DEPC H2O	to 17 μL

 

混匀后瞬离，按照下列反应程序进行反应：

温度	时间
94°C（片段化温度和时间可根据需求自行调整）	5-7 min
75°C	1 min
65°C	1 min
50°C	2 min
4°C	Hold

反应结束后接下游一链合成体系。

 

 

图3.二代测序验证一步法快速去除rRNA和Globin mRNA试剂盒的去除效果。DEPC H₂O：未使用去除rRNA和Globin mRNA的探针进行建库测序；Cat#12258+12260：在反应体系中同时使用本公司试剂盒Cat#12258+Cat#12260的探针去除rRNA和Globin mRNA后进行建库测序

 

2. 使用New England Biolabs的NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina (Cat#E7760)联合本试剂盒进行rRNA去除方案：

组份	体积
Total RNA	1 ng-1 μg
First Strand Synthesis Reaction Buffer (5×)	4 μL
Random Primers	1 μL
One-Step rRNA Removal Mix (Cat#12258)	1 μL
One-Step Globin mRNA Removal Mix (Cat#12260)	1 μL
DEPC H2O	to 10 μL

 
混匀后瞬离，按照下列反应程序进行反应：

温度	时间
94°C（片段化温度和时间可根据需求自行调整）	5-15 min
75°C	1 min
65°C	1 min
50°C	2 min
4°C	Hold

反应结束后接下游一链合成体系。
 

方案3：在mRNA NGS文库构建中去除Globin mRNA。

使用翌圣生物的Hieff NGS^® mRNA Isolation Master Kit mRNA (Cat#12603)进行本试剂盒mRNA的富集。

组份	体积
mRNA captured from total RNA	X*
2×Frag/Prime Buffer	8.5 μL
One-Step Globin mRNA Removal Mix (Cat#12260)	1 μL
DEPC H2O	to 17 μL

 

吹打悬浮oligo (dT)磁珠，按照下列反应程序进行反应：

温度	时间
94°C（片段化温度和时间可根据需求自行调整）	5-7 min
75°C	1 min
65°C	1 min
50°C	2 min
4°C	Hold

【注】：*从100 ng-4 μg总RNA中进行捕获得到的mRNA

 

反应结束后接下游一链合成体系。

 

 

HB210809