产品简介

 

Hieff NGS ^® MaxUp Human rRNA Depletion Kit (rRNA & ITS/ETS)利用RNase H消化法去除人、小鼠和大鼠来源总RNA

中的核糖体 RNA 和 45S ITS/ETS 区域以保留信使 RNA (mRNA)和其它非编码 RNA。该试剂盒对于完整和部分降解的总 RNA（如FFPE RNA）均具有良好的rRNA 去除效果。由于降解的FFPE样本相比新鲜组织样本通常含有较高比例的ITS/ETS， 该试剂盒人、小鼠和大鼠 45S ITS/ETS 区域的探针，经该试剂盒去除后可显著提高测序结果中有效数据比例。

 

组分信息

 

组分编号		组分名称	12257ES12	12257ES24	12257ES96
12257-A	●	Hybridization Buffer	36 μL	72 μL	288 μL
12257-B	●	Human Probe Mix (rRNA & ITS/ETS)	24 μL	48 μL	192 μL
12257-C	●	RNase H Buffer	36 μL	72 μL	288 μL
12257-D	●	RNase H	192 μL	192 μL	192 μL
12257-E	●	DNase I Buffer	330 μL	660 μL	2×1320 μL
12257-F	●	DNase I	30 μL	60 μL	240 μL

 

储存条件

 

-25~-15℃保存，有效期1年。

 

注意事项

 

1. 请使用无 RNase 污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用 Thermo Fisher 公司的 RNAZap^TM 高效核酸去除喷雾去除 RNA 酶污染。

2. RNA 样品应不含基因组 DNA 污染，若样品中有 gDNA 残留，应先进行 DNase I 消化并纯化后再用于本试剂盒。

3. RNA 样品最大投入体积为 10 μL，若样品体积较大，可先进行浓缩。

4. RNase H 消化步骤如需配 Mix 使用，请现配现用；该组分12 T和24 T规格的装量会有剩余。

5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

6. 本产品仅作科研用途！

 

使用说明

 

自备材料：

1. RNA纯化磁珠：Hieff NGS^® Cleaner (Cat#12602)或其他等效产品。

2. qRT-PCR质检rRNA去除效率：Hieff^® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) (Cat#11201)或其他等效产品。

3. 其他材料： 无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

操作步骤

1. 探针杂交

1.1 将探针和杂交Buffer从-20 °C 取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

1.2 准备RNA样品：根据投入量和样品浓度，计算RNA取样体积，用Nuclease free H₂O稀释至10 μL。

1.3 按照表1于200 μL PCR管中配制rRNA去除反应体系。

表1 探针杂交反应体系

名称	体积 (μL)
Hybridization Buffer	3
Human Probe Mix (rRNA&ITS/ETS)	2
Total RNA	10 (100 ng~1 μg)
Total	15

1.4 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

1.5 将上述 PCR 管置于PCR仪中，按照表2所示反应程序，进行探针杂交反应。

表2 探针杂交反应程序

温度	时间
热盖105°C	On
95 °C	2 min
95 °C-22 °C	0.1 °C/s
22 °C	5 min
4 °C	hold

2. RNase H消化

2.1 将RNase H消化试剂从-20 °C取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。按照表 3 所示，配制RNase H消化反应体系。

表3 RNase H消化反应体系

名称	体积 (μL)
RNase H Buffer	3
RNase H	2
上步产物	15
Total	20

注：RNase H Buffer及RNase H需单独添加，若因样本量较多需配置mix，请现配现用，否则会影响去除效果。

2.2 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

2.3 将上述 PCR 管置于PCR仪中，设置反应程序：热盖50 °C；37 °C，30 min； 4 °C，hold，进行RNase H消化反应。

3. DNase I 消化

3.1 将DNase I消化试剂从-20 °C 取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。按照表4所示，配制DNase I消化反应体系。

表4 DNase I消化反应体系

名称	体积 (μL)
DNase I Buffer	27.5
DNase I	2.5
上一步产物	20
Total	50

3.2 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

3.3 将上述 PCR 管置于PCR仪中，设置反应程序：热盖50 °C；37 °C，30 min；4 °C，hold，进行DNase I消化反应。

4. RNA纯化

4.1 准备工作：将Hieff NGS® RNA Cleaner (Cat#12602)磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少 30 min。用Nuclease free H₂O配制 80%乙醇。

4.2 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

4.3 吸取110 μL Hieff NGS® RNA Cleaner (2.2×，Beads:DNA=2.2:1)至上一步产物中，移液器充分吹打混匀，室温孵育 5 min。

4.4 将PCR管置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。

4.5 保持PCR管始终置于磁力架中，加入 200 μL Nuclease free H₂O新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec 后，小心移除上清。

4.6 重复步骤 4.5，总计漂洗两次。用 10 μL移液器吸干净残留液体。

4.7 保持PCR 管始终置于磁力架中，室温下开盖干燥磁珠 (5~10 min)。

4.8 RNA洗脱：将PCR 管从磁力架上取下，加入 11 μL Nuclease free H₂O（或使用适合下游实验的相应体积Nuclease free H₂O或洗脱缓冲液），使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置 5 min。

4.9 将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取10 μL上清（可根据步骤4.7选择的实际洗脱体积进行相应调整）至新的Nuclease free PCR 管中。

【注】：洗脱后的样品请立即进行下游实验，或置于-80 °C存放。

 

 

案例展示

不同Human RNA样本分别不含ITS/ETS去除rRNA、使用含ITS/ETS的Cat#12257去除rRNA及ITS/ETS后衔接RNA建库试剂盒进行文库构建，经测序分析rRNA与ITS/ETS在下机数据中的占比。

表：不同RNA质量样本使用含或者不含ITS/ETS探针的测试数据展示

RNA质量	去除方案	Input	rRNA (%)	ITS/ETS (%)	Mapping (%)
293T RNA; RIN=10	去除rRNA	1 μg	0.19	4.6	98.28
	去除rRNA及ITS/ETS	1 μg	0.15	0.04	98.79
FFPE RNA DV200 =90%	去除rRNA	500 ng	0.23	4.75	95.35
	去除rRNA及ITS/ETS	500 ng	0.21	0.02	95.42
FFPE RNA DV200 =50%	去除rRNA	500 ng	1.4	16.28	95.57
	去除rRNA及ITS/ETS	500 ng	0.56	0.11	95.51
FFPE RNA DV200 =20%	去除rRNA	1 μg	0.35	67.61	58.4
	去除rRNA及ITS/ETS	1 μg	0.79	0.84	60.35

 

 

Ver.CN20250307