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Hieff NGS® MaxUp Human rRNA Depletion Kit (rRNA & ITS/ETS)利用RNase H消化法去除人、小鼠和大鼠来源总RNA中的核糖体RNA和45S ITS/ETS区域以保留信使RNA (mRNA)和其它非编码RNA。该试剂盒对于完整和部分降解的总RNA（如FFPE RNA）均具有良好的rRNA去除效果。由于降解的FFPE样本相比新鲜组织样本通常含有较高比例的ITS/ETS，该试剂盒人、小鼠和大鼠45S ITS/ETS区域的探针，经该试剂盒去除后可显著提高测序结果中有效数据比例。
适用范围
适用于人、小鼠和大鼠来源的100 ng~1 μg总RNA样品；适用于完整或部分降解RNA（如FFPE RNA）样品。
产品组分
|
组分编号和名称 |
12257ES24 |
12257ES96 |
||
|
12257-A |
 |
Hybridization Buffer |
72 μL |
288 μL |
|
12257-B |
 |
Human Probe Mix (rRNA & ITS/ETS) |
48 μL |
192 μL |
|
12257-C |
 |
RNase H Buffer |
72 μL |
288 μL |
|
12257-D |
 |
RNase H |
48 μL |
192 μL |
|
12257-E |
 |
DNase I Buffer |
660 μL |
2×1320 μL |
|
12257-F |
 |
DNase I |
60 μL |
240 μL |
运输与保存方法
干冰运输，-20 °C存放。有效期1年。
注意事项
1. 请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用Thermo Fisher公司的RNAZapTM 高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。
2. RNA样品应不含基因组DNA污染，若样品中有gDNA残留，应先进行DNase I消化并纯化后再用于本试剂盒。
3. RNA样品最大投入体积为10 μL，若样品体积较大，可先进行浓缩。
4. RNase H 消化步骤如需配Mix使用，请现配现用。
5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
6. 本产品仅作科研用途！
自备材料
1. RNA纯化磁珠：Hieff NGS® Cleaner (Cat#12602)或其他等效产品。
2. qRT-PCR质检rRNA去除效率：Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) (Cat#11201)或其他等效产品。
3. 其他材料： 无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。
操作步骤
1. 探针杂交
1.1 将探针和杂交Buffer从-20 °C 取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
1.2 准备RNA样品：根据投入量和样品浓度，计算RNA取样体积，用Nuclease free H2O稀释至10 μL。
1.3 按照表1于200 μL PCR管中配制rRNA去除反应体系。
表1 探针杂交反应体系
|
名称 |
体积 (μL) |
|
Hybridization Buffer |
3 |
|
Human Probe Mix (rRNA&ITS/ETS) |
2 |
|
Total RNA |
10 (100 ng~1 μg) |
|
Total |
15 |
1.4 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。
1.5 将上述 PCR 管置于PCR仪中，按照表2所示反应程序，进行探针杂交反应。
表2 探针杂交反应程序
|
温度 |
时间 |
|
热盖105°C |
On |
|
95 °C |
2 min |
|
95 °C-22 °C |
0.1 °C/s |
|
22 °C |
5 min |
|
4 °C |
hold |
2. RNase H消化
2.1 将RNase H消化试剂从-20 °C取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。按照表 3 所示，配制RNase H消化反应体系。
表3 RNase H消化反应体系
|
名称 |
体积 (μL) |
|
RNase H Buffer |
3 |
|
RNase H |
2 |
|
上步产物 |
15 |
|
Total |
20 |
注：RNase H Buffer及RNase H需单独添加，若因样本量较多需配置mix，请现配现用，否则会影响去除效果。
2.2 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。
2.3 将上述 PCR 管置于PCR仪中，设置反应程序：热盖50 °C；37 °C，30 min； 4 °C，hold，进行RNase H消化反应。
3. DNase I 消化
3.1 将DNase I消化试剂从-20 °C 取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。按照表4所示，配制DNase I消化反应体系。
表4 DNase I消化反应体系
|
名称 |
体积 (μL) |
|
DNase I Buffer |
27.5 |
|
DNase I |
2.5 |
|
上一步产物 |
20 |
|
Total |
50 |
3.2 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。
3.3 将上述 PCR 管置于PCR仪中，设置反应程序：热盖50 °C；37 °C，30 min；4 °C，hold，进行DNase I消化反应。
4. RNA纯化
4.1 准备工作：将Hieff NGS® RNA Cleaner (Cat#12602)磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少 30 min。用Nuclease free H2O配制 80%乙醇。
4.2 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
4.3 吸取110 μL Hieff NGS® RNA Cleaner (2.2×，Beads:DNA=2.2:1)至上一步产物中，移液器充分吹打混匀，室温孵育 5 min。
4.4 将PCR管置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。
4.5 保持PCR管始终置于磁力架中，加入 200 μL Nuclease free H2O新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec 后，小心移除上清。
4.6 重复步骤 4.5，总计漂洗两次。用 10 μL移液器吸干净残留液体。
4.7 保持PCR 管始终置于磁力架中，室温下开盖干燥磁珠 (5~10 min)。
4.8 RNA洗脱：将PCR 管从磁力架上取下，加入 11 μL Nuclease free H2O（或使用适合下游实验的相应体积Nuclease free H2O或洗脱缓冲液），使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置 5 min。
4.9 将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取10 μL上清（可根据步骤4.7选择的实际洗脱体积进行相应调整）至新的Nuclease free PCR 管中。
【注】：洗脱后的样品请立即进行下游实验，或置于-80 °C存放。
案例展示
不同Human RNA样本分别不含ITS/ETS去除rRNA、使用含ITS/ETS的Cat#12257去除rRNA及ITS/ETS后衔接RNA建库试剂盒进行文库构建，经测序分析rRNA与ITS/ETS在下机数据中的占比。
表：不同RNA质量样本使用含或者不含ITS/ETS探针的测试数据展示
|
RNA质量 |
去除方案 |
Input |
rRNA (%) |
ITS/ETS (%) |
Mapping (%) |
|
293T RNA; RIN=10 |
去除rRNA |
1 μg |
0.19 |
4.6 |
98.28 |
|
去除rRNA及ITS/ETS |
1 μg |
0.15 |
0.04 |
98.79 |
|
|
FFPE RNA |
去除rRNA |
500 ng |
0.23 |
4.75 |
95.35 |
|
去除rRNA及ITS/ETS |
500 ng |
0.21 |
0.02 |
95.42 |
|
|
FFPE RNA |
去除rRNA |
500 ng |
1.4 |
16.28 |
95.57 |
|
去除rRNA及ITS/ETS |
500 ng |
0.56 |
0.11 |
95.51 |
|
|
FFPE RNA |
去除rRNA |
1 μg |
0.35 |
67.61 |
58.4 |
|
去除rRNA及ITS/ETS |
1 μg |
0.79 |
0.84 |
60.35 |
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|
建库试剂盒 |
产品编号 |
规格 |
|
Hieff NGS® Ultima DNA Library Prep Kit for Illumina® |
12199ES24/96 |
24/96 T |
|
Hieff NGS® MaxUpⅡ DNA Library Prep Kit for Illumina® |
12200ES24/96 |
24/96 T |
|
Hieff NGS® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina® |
12205ES24/96 |
24/96 T |
|
Hieff NGS® OnePotⅡ DNA Library Prep Kit for Illumina® |
12204ES24/96 |
24/96 T |
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Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina® |
12206/7ES24/96 |
24/96 T |
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Hieff NGS® MaxUpⅡ Dual-mode RNA Library Prep Kit |
12308ES24/96 |
24/96 T |
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Hieff NGS® MaxUpⅡ Dual-mode mRNA Library Prep Kit |
12309ES24/96 |
24/96 T |
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文库构建磁珠 |
产品编号 |
规格 |
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Hieff NGS® Smarter DNA Clean beads (>50 bp) |
12600ES08/56 |
5/60 mL |
|
Hieff NGS® DNA Selection Beads (Superior AMPure XP alternative) |
12601ES08/56 |
5/60 mL |
|
Hieff NGS® RNA Cleaner |
12602ES08/56 |
5/60 mL |
|
Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit |
12603ES24/96 |
24/96 T |
|
建库接头 |
产品编号 |
规格 |
|
Hieff NGS® 96 Single Index Primer Kit for Illumina®, Set 1/2 |
12611/12612ES02 |
48×2 T |
|
Hieff NGS® 384 Dual Index Primer Kit for Illumina®, Set 1/2 |
12412/12413ES02 |
96×2 T |
|
Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1/2 |
12615/12616ES04/16 |
12×4/12×16 T |
|
Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 3/4 |
12617/12618ES04/16 |
12×4/12×16 T |
|
Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina®, (96 Index) |
12416ES96/384 |
96 T/384 T |
|
建库模块 |
产品编号 |
规格 |
|
Hieff NGS® Fast-Pace DNA Fragmentation Reagent |
12609ES24/96 |
24/96 T |
|
Hieff NGS® Ultima DNA Ligation Module |
12604ES24/96 |
24/96 T |
|
Hieff NGS® Ultima Endprep Mix |
12605ES24/96 |
24/96 T |
|
Hieff NGS® Fast-Pace DNA Ligation Module |
12607ES24/96 |
24/96 T |
|
Hieff NGS® Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Module |
12608ES24/96 |
24/96 T |
|
2×Ultima Amplification Mix |
12620ES24/96 |
24/96 T |
|
2×Super Canace®Ⅱ High-Fidelity Mix |
12621ES03/08 |
24/96 T |
|
Hieff NGS® Dual-Mode cDNA Synthesis Kit |
12250ES24/96 |
24/96 T |
|
Hieff NGS® FFPE DNA Repair Reagent |
12606ES24/96 |
24/96 T |
|
文库定量 |
产品编号 |
规格 |
|
Hieff NGS® Library Quantification Kit for Illumina®, qPCR Master Mix |
12302ES05 |
500 T |
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Hieff NGS® Library Quantification Kit for Illumina®, DNA Standard (1-6) |
12307ES09 |
6×96 μL |
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12640ES60/76 |
100/500 T |
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NGS建库原料酶咨询 |
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