产品说明书
FAQ
COA
已发表文献
Hifair® IV Reverse Transcriptase是在Hieff® M-MLV (H-) Reverse Transcriptase基础上通过基因工程技术得到的全新逆转录酶，与Hieff® M-MLV (H-) Reverse Transcriptase相比，其热稳定性大幅度提高，可耐受60℃，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，适合低拷贝基因的逆转录和mRNA文库构建。Hifair® IV Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升，可扩增长达10 kb的cDNA。
产品组分
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编号 |
组分 |
产品编号/规格 |
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11112ES92 (10000 U) |
11112ES93 (5×10000 U) |
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11112-A |
5×Hifair® IV Buffer |
250 μL |
1200 μL |
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11112-B |
Hifair® IV Reverse Transcriptase (200 U/μL) |
50 μL |
250 μL |
产品应用
全长cDNA文库构建；终点法PCR；实时定量PCR等。
活性定义
以Poly(A) .Oligo(dT)为模板-引物，在37℃，10 min内，将1 nmol的dTTP掺入为酸不溶性物质所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。
运输与保存方法
冰袋运输。-20ºC保存，有效期一年。
注意事项
1）请保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用耗材均需保证RNase free，以防止RNase污染；
2）所有操作均应在冰上进行，防止发生RNA降解；
3）为保证逆转录成功，建议使用高质量的RNA样本；
4）为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
5）本产品仅做科研用途！
第一链cDNA合成操作步骤
1. RNA变性（此步为可选步骤，RNA变性有助于打开二级结构，可在很大程度上提高第一链cDNA的产量。）
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组分 |
使用量 |
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RNase free ddH2O |
to 13 μL |
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Oligo (dT)18 (50 μM) or Random Primers (50 μM) or Gene Specific Primers(2 μM) |
1 μL |
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or 1 μL |
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or 1 μL |
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模板RNA |
Total RNA: 10 pg -5 μg或mRNA:1 pg-500 ng |
65℃加热5 min，迅速置于冰上冷却2 min。简短离心收集反应液后加入下表中的逆转录反应液，并用移液器轻轻吹打混匀。
2. 逆转录反应液配制
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组分 |
使用量 |
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上一步的反应液 |
13 μL |
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5×Hifair® IV Buffer |
4 μL |
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dNTP Mix(10 mM) |
1 μL |
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Hifair® IV Reverse Transcriptase (200 U/μL) |
1 μL |
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RNase Inhibitor (40 U/µL) |
1 μL |
3. 逆转录程序设置
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温度 |
时间 |
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25℃ |
5 min |
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50℃ |
15 min |
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85℃ |
5 min |
【注】：1）当使用Random Primers时，需25℃，孵育5 min；若使用Oligo (dT)18或Gene Specific Primers，此步可省略；
2）逆转录温度：推荐使用50℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到55℃-60℃；
3）85℃加热5 min，目的是使逆转录酶失活。
※ 逆转录产物可立即用于后续PCR或qPCR反应，也可-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。
HB221229
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